桑叶提取物的抑菌活性及其挥发性组分的气相色谱 -质谱分析

刘志明 王海英 张 爽

(1东北林业大学材料科学与工程学院,生物质材料科学与技术教育部重点实验室,黑龙江哈尔滨 150040;2东北林业大学林学院,黑龙江哈尔滨 150040)

桑叶提取物的抑菌活性及其挥发性组分的气相色谱 -质谱分析

刘志明1王海英2张 爽2

(1东北林业大学材料科学与工程学院,生物质材料科学与技术教育部重点实验室,黑龙江哈尔滨 150040;2东北林业大学林学院,黑龙江哈尔滨 150040)

通过对桑叶正己烷提取物、桑叶二氯甲烷提取物进行抑菌活性试验和对桑叶正己烷提取物中挥发性组分进行气相色谱 -质谱分析结果表明:桑叶正己烷提取物、桑叶二氯甲烷提取物对金黄色葡萄球菌均有抑制作用,桑叶正己烷提取物的抑菌圈直径为7.11mm,桑叶二氯甲烷提取物的抑菌圈直径为7.09mm,而桑叶正己烷提取物与桑叶二氯甲烷提取物对大肠杆菌均无抑制作用。气相色谱 -质谱检测分析桑叶正己烷提取物的主要挥发性组分及其质量分数为十八烷(39.48%)、环二十八烷(8.79%)、棕榈酸 (7.19%)、二十九烷 (6.61%)、邻苯二甲酸二丁酯 (6.22%)、亚麻醇 (6.01%)、丁香酚(0.40%),其中的亚麻醇和丁香酚是具有抑菌潜力的化合物。

桑叶提取物;正己烷;二氯甲烷;抑菌活性;挥发性组分;气相色谱-质谱法

桑叶是桑科(Moraceae)植物桑(Morus alba L.)的叶片,又名“铁扇子”或“蚕叶”,是传统中草药之一［1-3］。桑叶中含有黄酮类、生物碱类、多糖类、植物甾醇类、挥发油类、氨基酸、维生素等化合物,具有降血糖、降血脂、抗菌等功效［4-6］。李有贵等［7］研究了 59份野生桑桑叶中的 1-脱氧野尻霉素含量及粗提物对 α-糖苷酶的抑制活性,多羟基生物碱 1-脱氧野尻霉素是桑叶提取物中具有降血糖作用的主要活性成分之一。仝义超［8］进行了桑叶降血糖、降血脂研究及其产品开发。郭小补等［9］进行了不同桑品种的桑叶总黄酮含量与体外抗氧化活性的相关性研究。桑叶除了作为中草药应用于医药领域,还可应用于食品等领域［3,10-12］。杨清等［13］进行了桑红茶发酵工艺条件优化及活性成分含量的动力学研究,杨普香等［14］研究了桑叶含片的加工。桑叶高附加值产品的开发利用已成为桑叶产品开发的热点之一。研究表明鲜桑叶水浸出液［15］、干桑叶乙醇提浸膏［16］、新鲜桑叶汁［17］以及质量浓度为 0.1 g/m L的干桑叶水提取物［18］对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等均有抑制作用。

桑叶提取物的抑菌活性因桑叶的生长环境、桑叶活性物质的提取方式不同而有差异。植物在生长过程中通过次生代谢产生的挥发性物质具有防御害虫、抑菌等作用,从而保护自身不受病虫害侵害［19-23］,将植物中的挥发性有效成分提取出来进行产品开发是当今回归自然、环境友好产品开发的研究重点之一。本研究对利用正己烷和二氯甲烷浸提桑叶获得的提取物进行抑菌活性比较,并采用气相色谱 -质谱(GC-MS)法分析提取物的挥发性组分,探讨桑叶提取物的有效活性组分,为桑叶的高附加值产品开发提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试桑叶:龙桑一号的 3年嫁接苗的新鲜叶片,2009年 8月下旬采摘于黑龙江省齐齐哈尔市甘南林场桑产业科技示范园。

供试菌株:金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia coli),均购自黑龙江省科学院应用微生物研究所。在无菌条件下用划线法将供试菌株移接入斜面培养基上,在 37℃培养箱中培养 24 h。取出活化好的菌株,用适量无菌 9 g/L氯化钠溶液,将金黄色葡萄球菌和大肠杆菌分别配置成浓度为 9×106、5×106cfu/mL的菌悬液备用。

主要药品与仪器:正己烷、二氯甲烷均为分析纯,均购自天津市科密欧化学试剂开发中心;超净工作台,上海博讯实业有限公司医疗设备厂生产;SPX-80B生化培养箱,DSX-180A手提式高压蒸汽灭菌锅,均为上海跃进医疗器械厂生产;GC-MS 6890N-5973 insert气相色谱 -质谱联用仪,美国 Agilent公司生产。培养基:蛋白胨 10 g,氯化钠 10 g,酵母提取物 5 g,琼脂 20 g,去离子水 1 000 mL,用1 mol/L氢氧化钠溶液调节 pH 7.0～7.5。

1.2 试验方法

1.2.1 桑叶正己烷与二氯甲烷提取物的制备 各取 15 g鲜桑叶(整片)放入 2个 500mL索氏提取器中,分别加入 300mL正己烷、二氯甲烷,在恒温水浴85℃下连续回流提取 24 h,提取液经旋转薄膜蒸发器蒸去溶剂,得到桑叶正己烷或二氯甲烷提取物浸膏;分别将提取物浸膏用二氯甲烷溶解,配制成质量浓度为 0.1 g/m L的溶液备用。

1.2.2 桑叶正己烷与二氯甲烷提取物的抑菌活性试验 采用滤纸片法［16］和平板菌落计数法［18］进行抑菌试验。将移液器、镊子、培养基、9 g/L NaCl溶液、试管及三角瓶等用牛皮纸包好,滤纸用打孔器打成 6mm的纸片,装于洁净三角瓶中,置于高压灭菌锅内,121℃下湿热灭菌 20min,备用。用移液器吸取金黄色葡萄球菌、大肠杆菌悬液 0.05 m L于无菌平皿中,然后倒入已冷却至 45℃的培养基15m L,充分混匀后水平放置,制成含菌平板。用镊子将滤纸片放入桑叶正己烷提取物、桑叶二氯甲烷提取物溶液中,浸泡 10min后取出,待溶剂挥发后,将纸片贴在含菌平板上,每个平板贴 3片滤纸,每个纸片相隔一定间距,并用浸有二氯甲烷的滤纸片作对照,贴上标签。每个处理 3个重复。放入培养箱37℃下培养24 h,测定抑菌圈直径,取其平均值。以上操作均在超净工作台上完成。

1.2.3 桑叶正己烷提取物的气相色谱 -质谱分析(GC-MS) 用甲醇(色谱纯)将桑叶正己烷提取物(经旋转薄膜蒸发器蒸去正己烷获得的提取物)配制成质量浓度为 0.04 g/m L的溶液,利用 GC-MS 6890N-5973insert气相色谱 -质谱联用仪,对0.04 g/mL提取物甲醇溶液进行气质联用分析。气相色谱分析条件:DB-17MS毛细管柱(30 m×0.25mm×0.25μm),FID检测器;初始温度 40℃,保持 4min后以20℃/m in升温至150℃,接着再以5℃/m in升温至 240℃,保持 5 min;进样口温度260℃,进样量 1.0μL,不分流,载气氦气,流速1m L/min。质谱条件:连接口温度 280℃,离子源温度 230℃,轰击电压 70 eV,扫描检测范围 15～260 u。

2 结果与分析

2.1 桑叶正己烷与二氯甲烷提取物的抑菌活性比较

从桑叶正己烷与二氯甲烷提取物对供试菌种的抑制效果看(表 1),桑叶正己烷与桑叶二氯甲烷提取物均对金黄色葡萄球菌有较强的抑制作用,抑菌圈直径分别为 7.11、7.09mm;从表 1中还可看出桑叶正己烷提取物与桑叶二氯甲烷提取物对大肠杆菌均无抑制作用。

表 1 桑叶正己烷与二氯甲烷提取物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑制效果

2.2 桑叶正己烷提取物的气相色谱 -质谱分析

由于抑菌试验中常需要检测金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌效果,且正己烷是常用的提取植物天然产物较好的溶剂之一,加上桑叶正己烷提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径较大;因此,下面只对桑叶正己烷提取物进行气相色谱 -质谱分析。

经计算机 NIST质谱库自动检索、解析和部分化合物的人工解析,鉴定出桑叶正己烷提取物中有 13种挥发性成分,通过面积归一化法计算各组分的质量分数(表 2)。从表 2可以看出,桑叶正己烷提取物中主要挥发性组分为十八烷(39.48%)、环二十八烷 (8.79%)、棕榈 酸 (7.19%)、二十九 烷(6.61%)、邻苯二甲酸二丁酯(6.22%)、亚麻醇(6.01%)、邻苯二甲酸二异丁酯(4.38%);此外,桑叶正己烷提取物中还含有丁香酚、植醇、亚麻酸甲酯等挥发性组分。

表 2 桑叶正己烷提取物挥发性组分的气相色谱-质谱分析

3 小结与讨论

桑叶的传统应用主要是作为药用(中草药)和饲用(养蚕饲料),将桑叶中的有效成分提取出来,应用于食品等产品开发,是提高桑叶经济附加值的手段之一。用植物天然产物的常用提取剂正己烷和二氯甲烷分别浸提桑叶,获得的桑叶提取物进行抑菌活性试验,结果表明:桑叶正己烷的提取物与桑叶二氯甲烷的提取物,对金黄色葡萄球菌均有抑制作用,但对大肠杆菌均无抑制作用。对桑叶正己烷提取物进行气相色谱 -质谱分析的结果表明,其提取物中含有亚麻醇、丁香酚等具有抑菌作用的挥发性组分。有研究表明,亚麻醇可以作为抗菌剂预防龋齿和牙周病［24］,丁香酚也具有抑菌作用［25］。关于桑叶正己烷提取物的抑菌活性物质的分离、鉴定及其抑菌机制有待于进一步研究。

［1］张秀实,吴征镒.中国植物志［M］.北京:科学出版社,1998:7-9.

［2］陈仁寿.2005年版国家药典中药实用手册［M］.2版.南京:江苏科学技术出版社,2007:27-29.

［3］聂绍荃,袁晓颖,杨逢建.黑龙江植物资源志［M］.哈尔滨:东北林业大学出版社,2003:186-189.

［4］苏方华.桑叶的化学成分及临床应用研究进展［J］.中国医药导报,2010,7(14):9-12.

［5］徐健飞,义祥辉,陈全斌.桑叶不同化学成分的降血糖作用［J］.广西植物,2010,30(2):284-286.

［6］杨燕,王洪庆,陈若芸.桑叶中的黄酮类化合物［J］.药学学报,2010,45(1):77-81.

［7］李有贵,储一宁,钟石,等.59份野生桑桑叶中的 DNJ含量及粗提物对 α-糖苷酶的抑制活性［J］.蚕业科学,2010,36(5):729-737.

［8］仝义超.桑叶降血糖降血脂研究及其产品开发［D］.杭州:浙江工商大学,2010.

［9］郭小补,廖森泰,刘吉平,等.不同桑品种的桑叶总黄酮含量与体外抗氧化活性的相关性［J］.蚕业科学,2008,34(3):381-386.

［10］欧阳臻,陈钧.桑叶的化学成分及其药理作用研究进展［J］.江苏大学学报(自然科学版),2003,24(6):39-44.

［11］李有贵,时连根.桑叶在医药中的开发应用［J］.中国蚕业,2004,25(1):77-79.

［12］任培华,付子文,何伟.功能性食品原料——桑叶［J］.中国蚕业,2005,26(4):55-56.

［13］杨清,徐立,王俊,等.桑红茶发酵工艺条件优化及活性成分含量的动力学研究［J］.蚕业科学,2010,36(2):221-228.

［14］杨普香,杨帆,何杨林,等.桑叶含片的加工［J］.中国蚕业,2009,30(3):101-102.

［15］宓伟,刘珍,王志强,等.鲜桑叶体外抑菌作用研究［J］.食品与药品,2007,9(10A):32-33.

［16］花蕾,张文清,赵显峰.桑叶水提浸膏的抑菌作用研究［J］.上海生物医学工程,2007,28(1):16-18.

［17］樊黎生.桑叶抑菌效果的探讨［J］.天然产物研究与开发,2001,13(4):30-32.

［18］廖玉婷.桑叶的抑菌作用及其活性物质的提取分离研究［D］.无锡:江南大学,2007.

［19］莫小路,朱庆玲,陈瑜珍,等.几种植物精油的抗菌作用研究［J］.中成药,2010,32(7):1 213-1 215.

［20］吴楚材,吴章文,罗江滨.植物精气研究［M］.北京:中国林业出版社,2006,203-205.

［21］李卫国,张乐伟,王超,等.桑叶挥发性成分的静态顶空 -气相色谱 -质谱分析［J］.蚕业科学,2009,35(2):355-361

［22］孙莲,杨文菊,刘龙.桑叶挥发油气相色谱 -质谱指纹图谱研究［J］.中国中药杂志,2009,34(7):879-883.

［23］曹明全,王海英,刘姗姗,等.鲜桑叶与干桑叶精油的挥发性组分分析［J］.国土与自然资源研究,2010,(2):86-87.

［24］Crout R J,Gilbertson JR,Gilbertson JD,et al.Effect of linolenyl alcohol on the in-vitro growth of the oral bacterium Streptococcus mutans［J］.Arch Oral Biol,1982,27(12):1 033-1 037.

［25］张雁南,陈艳,彭欣莉,等.丁香抑菌成分提取工艺研究［J］.食品科学,2010,31(12):25-27.

S888.2

A

1007-0982(2011)02-0026-03

2010-12-20;

2011-01-19

黑龙江省林业厅科技推广项目(编号 01043208003)。

刘志明(1971—),男,黑龙江,博士,副教授。

Tel:0451-82191740,E-mail:zhimingliuwhy@126.com