HPLC法同时测定补肾壮骨颗粒中淫羊藿苷及柚皮苷含量

韩丽萍， 陈行愉， 邓伟民

(广州军区广州总医院，广东广州 510010)

补肾壮骨颗粒由淫羊藿、骨碎补、鹿角胶等七味药材制成，具有补肾壮骨、健脾和胃、祛瘀止痛的作用，可用于各种原发性骨质疏松。其中淫羊藿和骨碎补为主药，淫羊藿中淫羊藿苷等黄酮类化合物为其主要活性成分，骨碎补其主要活性成分为柚皮苷等二氢黄酮类化合物。笔者曾对补肾壮骨颗粒中的淫羊藿苷进行测定［1］，但对于一个复方制剂而言，仅对其中一种成分进行测定，还略显不足，为了更进一步地评价补肾壮骨颗粒的质量，本实验参考相关文献［2］，采用HPLC法同时测定淫羊藿苷及柚皮苷含量。结果证明，该法操作简便，重现性好，且准确稳定，可为全面评价补肾壮骨颗粒的质量提供依据。

1 仪器与材料

Agilent 1100高效液相色谱仪:配有二元梯度泵、在线脱气机、自动进样器、柱温箱、DAD检测器、Chemstation色谱工作站(美国惠普公司)，Sartorius BP211D分析天平(德国赛多利斯公司)，KP-Q-1200超声波清洗机(广州科普超声电子技术有限公司)。

补肾壮骨颗粒(广州军区总医院制剂中心提供，批号分别为 081114，090402，090605，090921)，淫羊藿苷、柚皮苷对照品(中国药品生物制品检定所，批号分别为110737-200415、110722-200610)，95%乙醇、甲醇(分析纯)、乙腈(色谱纯，为SIGAM产品)。流动相用水为重蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件和系统适应性试验 色谱柱:Inertsil C18柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流动相:A 相为水，B 相为乙腈，B相浓度梯度:0～8 min，体积分数为25%，8～9 min，体积分数为25% ～30%，9～22 min，体积分数为30%，检测波长285 nm;流速1 mL/min;柱温30℃;进样量10 μL。各峰的理论塔板数不低于3 000，与相邻的峰的分离度均大于1.5。在上述色谱条件下，对照品、样品和阴性样品的色谱图见图1。

2.2 线性关系考察 分别取淫羊藿苷及柚皮苷对照品适量，精密称定，置10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，制成1 mL约含淫羊藿苷0.6 mg，柚皮苷0.4 mg的混合对照品贮备溶液。精密吸取对照品贮备溶液适量，加甲醇分别稀释成每毫升含柚皮苷约为 0.4、0.08、0.04、0.016、0.008、0.004 mg，含淫羊藿苷约为 0.6、0.12、0.06、0.024、0.012、0.006 mg的对照品系列溶液，精密吸取10 μL，注入液相色谱仪，以峰面积对质量浓度进行线性回归，得各组分的线性范围和回归方程，淫羊藿苷在进样量0.060 6～6.6 μg范围内线性关系良好，Y=1 053.6X+9.400 7，r=0.999 9;柚皮苷在进样量0.087 4～8.74 μg范围内线性关系良好，回归方程:Y=1 538.8X+27.511，r=0.999 9。

淫羊藿苷和柚皮苷的最低检出限分别为20.2 ng和29.1 ng，定量限分别为52.5 ng和75.7 ng。

2.3 供试品溶液制备方法考察 精密称取补肾壮骨颗粒约2 g，置圆底烧瓶中，精密加入甲醇50 mL，精密称定，考察下列提取方法:①浸泡2 h，超声提取30 min;②回流提取30 min;③浸泡2 h，超声提取30 min，继续回流提取30 min。上述3种提取液放冷至室温，以甲醇补足损失，滤过。精密吸取续滤液25 mL至蒸发皿中，水浴蒸干，残渣用甲醇溶解，置10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，0.22 μm微孔滤膜滤过，作为供试品溶液。

图1 补肾壮骨颗粒HPLC色谱图

取上述3种供试品溶液，按照2.1项下方法，测定淫羊藿苷和柚皮苷含量，结果表明，回流提取与超声提取对淫羊藿苷影响较小，而柚皮苷用回流提取优于超声提取，但单纯超声或回流提取，两种成分均不能提取完全，因此确定采用超声加回流的方法进行提取，见表1。

表1 不同制备方法对含量的影响(n=3)

2.4 精密度试验 按照2.3项下第三法制备供试品溶液，按照2.1项色谱条件下进样10 μL，重复6次，以淫羊藿苷和柚皮苷峰面积计算RSD，其结果分别为0.56%、0.58%，说明仪器精密度良好。

2.5 重复性试验 取同一批补肾壮骨颗粒样品(批号:090921)，按照2.4项下第三法平行制备6份供试品溶液，按照2.1项色谱条件下进样10 μL，计算淫羊藿苷和柚皮苷含量的RSD分别为1.17%、1.39%，说明该法重复性较好。

2.6 稳定性试验 取同一供试品，按照2.1项色谱条件分别在0、1、2、4、6、8、24 h 进样10 μL，测定峰面积，计算淫羊藿苷和柚皮苷峰面积的RSD分别为0.88%、1.15%。表明供试品溶液在24 h内稳定性良好，可满足测定要求。

2.7 加样回收率试验 取已知淫羊藿苷、柚皮苷含量的补肾壮骨颗粒(批号:090921)6份各约1 g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加入淫羊藿苷、柚皮苷对照品甲醇溶液适量，按2.4项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件测定含量，求得淫羊藿苷和柚皮苷的回收率，结果见表2。

2.8 样品含量测定 取大生产的4批样品，按2.4项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件，分别将混合对照品和供试品溶液进样10 μL，记录淫羊藿苷和柚皮苷的色谱峰面积，外标法计算含量，结果见表3。

表2 加样回收率试验结果(n=6)

表3样品测定结果(n=3)

3 讨论

由于柚皮苷和淫羊藿苷性质差异较大，为了能使两组分能按各自适宜的容量因子k达到良好的分离目的，以不同比例的乙腈-水为流动相对色谱条件进行考察。结果表明，当流动相为乙腈-水的起始浓度为25:75时，各组份能达到较好的分离。采用乙腈-水单一比例测定淫羊藿苷约10 min［1］，但柚皮苷不能很好分离。骨碎补药材中新北美圣草苷和柚皮苷的含量同时测定用时为20 min［3］，本方法2组分同时测定用时约20 min，缩短了多组份检测的分析时间。进一步的对比研究发现，梯度洗脱可以消除杂质对被测成分的干扰，避免因使用聚酰胺进行净化处理［1］导致被测成分的损失，大大节省了样品制备的时间及溶剂，适于全面评价补肾壮骨颗粒的质量。

淫羊藿苷的最大吸收波长为270 nm，柚皮苷的最大吸收波长为285 nm，本实验考察了在波长为270及285 nm条件下的吸收图谱，发现在285 nm单一波长下，淫羊藿苷及柚皮苷同时可以得到较好的色谱峰。也可用双通道检测，在270 nm波长下检测淫羊藿苷，在285 nm下波长检测柚皮苷。

本次实验对不同批次补肾壮骨颗粒含量进行测定，结果显示，不同批次样品之间淫羊藿苷含量差异较大，与笔者之前的报道［1］不相符，主要原因是报道中的3批样品均使用同一批次药材制备，而本次实验的样品使用不同批次药材制备，但市面上淫羊藿药材的质量参差不齐，笔者测定不同批次的淫羊藿药材，淫羊藿苷含量差异可达到10倍以上，因此控制原药材质量，是保证中药制剂质量的根本措施。

［1］韩丽萍，梁 达，刘志刚，等.补肾壮骨颗粒质量标准的研究［J］. 解放军药学学报，2009，25(2):145-147.

［2］李 超，葛 洁，鹿秀梅，等.RP-HPLC法测定骨疏丹颗粒中5种有效成分的含量［J］.沈阳药科大学学报，2008(9):728-731.

［3］李遇伯，孟繁浩，李发美，等.HPLC同时测定骨碎补药材中新北美圣草苷和柚皮苷的含量［J］.沈阳药科大学学报，2006，23(6):808-810.