隔山消不同极性提取物抗菌作用实验研究

洪小凤， 王 涛， 施贵荣， 王立云， 李 辉*

(1.云南省大理学院药学院，云南大理 671000;2.云南省大理学院基础医学院，云南大理 671000)

紫地榆Geranium strictipesKnuth，牻牛儿苗科老鹳草属植物，药用部位为根，民间称隔山消。该药在《大理中药资源志》、《中药大辞典》、《全国中草药汇编》等书籍中均有收载。其在民间主要用于治疗厌食、肠炎、红白痢疾、消化不良等病症［1］。已报道的化合物主要是鞣质类和酚酸类［2］，而对该药的有关药理、毒理、临床应用、药材标准等方面的研究报道都非常少。为了探讨隔山消在民间治疗肠炎、红白痢疾的药理作用基础，本课题组前期对隔山消粗提取物的体内外抗菌作用进行了初步研究，发现其具有显著的广谱抗菌作用［3］。为此，我们进一步研究隔山消不同极性部位提取物对临床分离的耐药菌株和常见致病菌的抑制作用。

1 材料与方法

1.1 药材 隔山消，购自大理集盛大药房。经鉴定为牻牛儿苗科植物紫地榆Geranium strictipesKnuth的干燥根。

1.2 供试菌株 金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌、大肠埃希菌、痢疾志贺菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、质控菌金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠埃希菌ATCC25922，均由大理学院基础医学院病原微生物教研室惠赠。

所有31株临床分离金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和铜绿假单胞菌来自大理州医院住院病人和门诊病人。根据菌落形态、革兰染色特点和胶乳凝集试验，经VITEK-32全自动微生物分析仪GPI鉴定卡(法国生物梅里埃公司生产)做菌株鉴定。共鉴定出MRSA13株、产超广谱β内酰胺酶(ESBLs)大肠埃希菌15株、铜绿假单胞菌1株。

1.3 培养基 MH琼脂(杭州天和微生物试剂有限公司，批号:090817);MH肉汤(杭州天和微生物试剂有限公司，批号:090526)。

1.4 仪器设备 AV-3070垂直型超净工作台(TELSTAR)，隔水式恒温培养箱(上海一恒科技有限公司)，YXQ-LS-50SII型立式压力蒸汽灭菌器(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)。

1.5 实验方法

1.5.1 耐药菌株的筛选 采用液体稀释法，参照NCCLS/CLIS2006 标准判断结果［4］。

1.5.2 药物的提取 取隔山消10.95 kg，粉碎后用85%乙醇回流提取3次。合并提取液减压浓缩得乙醇浸膏3.58 kg。浸膏用甲醇溶解后，用80～100目硅胶拌样，过硅胶柱层析，然后分别用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯和丙酮洗脱，浓缩各组分得石油醚部分、三氯甲烷部分、乙酸乙酯部分、丙酮部分。因石油醚部分和三氯甲烷部分量太少，此次实验只做乙酸乙酯部分及丙酮部分。临用前取乙酸乙酯和丙酮部分低温冷冻干燥成粉末，再用适当溶剂配制成所需浓度。

1.5.3 抑菌圈试验菌片的制备 将定性滤纸制成6 mm直径的圆片，高压蒸汽灭菌，干燥保存备用。取处理好的滤纸片放入灭菌培养皿内，每100片纸片滴加隔山消提取液100 μL，对照组滴加100 μL溶剂，每片含生药量约为2.57 mg。1.5.4 细菌悬液的制备［5-6］将所有供试菌株分别接种于MH琼脂平板上，置37℃恒温培养箱培养24 h活化，待用。挑取琼脂平板上形态相同的菌落，用灭菌生理盐水校正菌液浓度，使其相当于0.5麦氏比浊标准，再用MH肉汤稀释至含菌量约107CFU/mL。稀释后的菌液在15 min内接种。

1.5.5 MIC及MBC的测定［5-6］取灭菌小试管15支为一组。其中每组第13、14、15管分别标上“肉汤对照”、“检测菌对照”、“溶剂对照”。每支试管分别加入MH肉汤2 mL。配制隔山消乙酸乙酯提取物和丙酮提取物原液浓度为100 mg/mL。用吸管吸取药液2 mL放入第1管内，混匀后吸取2 mL放入第2管，同样混匀后吸出2 mL放入第3管。依此法逐管进行稀释至第12管。各管药物浓度分别为50、25、12.5、6.25、3.125、1.56、0.78、0.39、0.20、0.10、0.05 mg/mL，除“肉汤对照”管外其余各管均加入菌液0.1 mL，放入37℃恒温培养箱中培养24 h，取出，观察生长情况。在对照管符合要求的情况下，以肉眼未见生长的最低药物浓度为隔山消对细菌的MIC。再从未见细菌生长的试管中取0.02 mL于相应培养基的琼脂平板上作次代培养，培养过夜，观察有无细菌生长。平皿上计数少于5个菌落的最低药物浓度为隔山消对细菌的MBC。

实验中应用金黄色葡萄球菌ATCC25923和大肠埃希菌ATCC25922作为质控菌株。

1.5.6 K-B实验法 用无菌棉签蘸取0.5麦氏比浊标准的菌悬液，在管内壁将多余菌液旋转挤去后在琼脂表面均匀涂布，然后将含药纸片贴于琼脂表面。置37℃恒温培养箱孵育18～20 h后观察结果，测量抑菌圈直径。各稀释液的每项抑菌圈实验均平行重复6次。

结果判断:抑菌圈直径大于6 mm者为有抑菌作用，小于或等于6 mm者判为无抑菌作用。溶剂对照组应无抑菌圈产生，否则试验无效。

2 结果

2.1 隔山消提取物对各供试菌株的MIC和MBC测定

隔山消乙酸乙酯提取物和丙酮提取物对各实验菌株的MIC和MBC测定结果见表1。

表1 隔山消提取物对各实验菌株的MIC及MBC结果

由表1结果显示，隔山消提取物对各实验菌株均有不同程度的抑制作用，对葡萄球菌、痢疾志贺菌的抑制作用最强，乙酸乙酯部分MIC值均为0.39 mg/mL，丙酮部分均为0.78 mg/mL。对枯草芽孢杆菌作用次之，乙酸乙酯部分MIC值为1.56 mg/mL，丙酮部分为 3.125 mg/mL。

2.2 隔山消提取物纸片扩散法的抑菌实验结果

由表2可知，100、50、25 mg/mL的乙酸乙酯和丙酮提取物对MRSA及标准菌株均有明显抑制作用，并且随着浓度降低抑菌圈明显缩小(与对照组比较，P﹤0.001)。乙酸乙酯提取物抑菌圈大于相应浓度的丙酮提取物，差异有统计学意义(P﹤0.001)。各相应浓度抑菌圈直径与ATCC25923比较没有明显差异。

表2 隔山消提取物对13株MRSA菌株的抑制作用

表3结果显示，隔山消提取物50、25、12.5 mg/mL 3个浓度对金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌、痢疾志贺菌、枯草杆菌有不同程度的抑菌效果。

3 讨论

目前，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)及产超广谱β内酰胺酶(ESBLs)的肠杆菌科细菌已成为一些大型综合医院最常见的医院感染菌。同时又表现为多重耐药性，给临床治疗带来了极大的困难。

表3 隔山消提取物对各实验菌株的抑制作用

本课题组在前期实验中发现隔山消总提取物具有较强的广谱抗菌作用，因此拟定对其抗菌活性部位进行进一步追踪。实验结果显示，隔山消总提取物经硅胶柱层析得到的乙酸乙酯部分和丙酮部分对各菌株均显示出不同程度的体外抗菌活性，尤其是对葡萄球菌科细菌及痢疾志贺菌的抑制作用最强。整体来讲，乙酸乙酯提取物抑制细菌生长的作用较丙酮提取物略强。同一种提取物对MRSA、产ESBLs大肠埃希菌的不同菌株表现出相近的抑菌活性。并且，隔山消提取物对临床分离株和教学用的实验菌株也表现出相近的抑制作用。

本次实验结果显示，隔山消两种提取物对MRSA均有很强的抗菌活性，尤其是乙酸乙酯部分。目前，本课题组正针对乙酸乙酯部分进行进一步的分离及活性追踪，以期筛选出抗菌活性更强的天然抑菌剂。

［1］中国科学院昆明植物研究所.云南植物志［M］.第5卷，北京:科学出版社，1991:85.

［2］杨国红，陈道峰.紫地榆的化学成分及其抗艾滋病病毒活性［J］.中草药，2007，38(3):352-354.

［3］张娴文，李凤贤，王 晶.隔山消的抗菌作用实验研究［J］.中成药，2009，31(6):127-129.

［4］NCCLS.Performance Standards for Antimicrocbial Susceptility Testing:Sixteenth Informational Supplement［S］.National Committee for Clinical Laboratory Standards，2006.

［5］陈 奇，卞如濂，陈 修.中药药理研究方法学［M］.2版，北京:人民卫生出版社，2006:274-277.

［6］李志富，毛文奎，邵 伟，等.石榴皮乙醇提取物对临床分离菌株的抗菌作用及毒性试验研究［J］.中国消毒学杂志，2009，26(2):162-164.