多指标正交法优选樟帮枳壳饮片炮制工艺

张金莲， 谢一辉， 何 敏， 龚千锋， 姚冬琴， 李 果， 张的凤

(江西中医学院，江西南昌 330004)

枳壳系芸香科柑橘属植物酸橙Citrus aurantiumL.和栽培变种的干燥未成熟果实。一般于7月果皮尚绿时采收，自中部横切为两半，晒干或低温干燥。枳壳生用有理气宽中，行滞消胀的功效，用于胸胁气滞，胀满疼痛，痰饮内停，食积不化，脏器下垂［1］。枳壳在临床上除使用生品外，还常用炮制品，《中国药典》收载的炮制品种为麸炒枳壳。江西樟帮法炮制枳壳饮片的特色是需将枳壳上架压制，切制成“凤眼片”，麸炒或蜜麸炒［2］。本实验通过多指标正交法来优化樟帮枳壳的炮制工艺条件。

1 仪器与试药

1.1 仪器 ultimate 3000高效液相色谱仪，ultimate 3000 photodiode Array Detector，ultimate 3000 自动进样器，ultimate 3000柱温箱，ultimate 3000色谱工作站，AG245电子分析天平，Sartorius BS124电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)，HH－2数显恒温水浴锅(国华电器有限公司)，高速万能粉碎机(天津市泰斯特一仪器有限公司)，TN408LC型红外测温枪(上海仪迷杰光电技术有限公司)，KQ3200超声波清洗器(昆山超声仪器厂)，GZX－9146MBE型数显鼓风干燥箱(上海博讯实业有限公司)。

1.2 对照品 柚皮苷(中国药品生物制品检定所，批号110722－200309)、新橙皮苷(由江西中医学院重点实验室杨武亮教授提供，含量99.34%);色谱纯乙腈(美国Merck公司)，色谱纯甲醇(美国Merck公司)。其他试剂均为分析纯。

1.3 实验药材 枳壳原药材购自江西天齐堂中药饮片有限公司，经江西中医学院药学院中药资源学科组褚小兰教授鉴定为酸橙Citrus anrantiumL.干燥未成熟果实。

2 方法与结果

2.1 樟帮枳壳生品工艺研究

2.1.1 试验设计 以樟帮传统炮制方法的温湿度和时间为基础，结合预试验的情况，采用L16(45)正交表对炮制温度、炮制时间、炮制湿度三因素设计试验，每因素设计四个水平，因素水平表见表1。

表1 因素水平表

2.1.2 樟帮枳壳生品制备 枳壳原药材用小刀挖去内瓤，洗净泥沙，捞起，润过夜(12 h)，压扁，再上木架压制，依照正交设计表L16(45)进行饮片炮制后，取出，切成0.2 cm厚的凤眼片，干燥即得。

2.1.3 柚皮苷、新橙皮苷含量测定

2.1.3.1 色谱条件 色谱柱:ultimate 3000 C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)，流动相:乙腈－水(磷酸调pH值至3)(23∶77)，检测波长:283 nm，流速:1.0 mL/min，柱温:30℃。理论塔板数以柚皮苷计不低于3 000。对照品溶液、供试品溶液和溶剂的色谱图见图1。

2.1.3.2 对照品溶液的制备 精密称取柚皮苷对照品、新橙皮苷对照品适量，加无水甲醇制成每1 mL含柚皮苷对照品0.079 12 mg、新橙皮苷对照品0.047 mg的混合对照品溶液。

2.1.3.3 供试品溶液的制备 取枳壳粗粉约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，称定重量，加热回流提取1.5 h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5 mL置25 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

图1 高效液相色谱图

2.1.3.4 线性关系考察 取混合对照品溶液按2.1.3.1项下的色谱条件，自动进样 4、8、12、16、20 μL，分别记录色谱峰面积。以峰面积Y为纵坐标，进样量(μg)为横坐标，进行线性回归，回归方程分别为:柚皮苷:Y=32.24X－0.157 2，r=0.999 9，新橙皮苷:Y=38.872X+0.046 8，r=0.999 9。结果表明柚皮苷在 0.316 4 μg ～1.582 4 μg 范围内，新橙皮苷 0.188 0 μg～0.940 0 μg范围内线性关系良好。

2.1.3.5 精密度试验 精密吸取对照品混合溶液10 μL，注入色谱仪，在相同的色谱条件下，重复进样6次，以柚皮苷对照品、新橙皮苷对照品的峰面积计算，两者的RSD分别为2.28%，2.90%。结果表明精密度良好。

2.1.3.6 重复性试验 取枳壳药材粉末(40目)0.5 g，6份，精密称定，分别按2.1.3.3项下方法制备供试品溶液，平行测定，供试品柚皮苷和新橙皮苷含量的RSD分别为0.61%，1.36%。结果表明该方法重现性良好。

2.1.3.7 稳定性试验精密称取枳壳药材粉末(40目)0.5 g，按2.1.3.3项下制备供试品溶液，分别在0、1、2、4、5 d 进样 10 μL，记录色谱峰面积，计算柚皮苷和新橙皮苷色谱峰面积的RSD分别1.02%，2.00%，表明120 h内供试品稳定性良好。

2.1.3.8 加样回收率试验 精密称取已知柚皮苷和新橙皮苷含量的枳壳药材6份，每份约0.25g，分别加入柚皮苷和新橙皮苷适量，按2.1.3.3项下的方法制备供试品溶液，测定，计算回收率，结果柚皮苷回收率为99.17%，RSD=2.26%(n=6)、新橙皮苷回收率为96.11%，RSD=3.17%(n=6)。

2.1.3.9 样品测定 取按正交设计表炮制的枳壳饮片按2.1.3.3项下操作制备样品溶液，进样10 μL，测定，计算柚皮苷、新橙皮苷的含量。

2.1.4 性状指标测定 枳壳压制后需经发酵霉变并制成“凤眼片”是樟帮枳壳的特色之一，霉变太过则影响外观，不及则无法制成“凤眼片”，故对样品的霉变性状和成型性进行评分，评分标准见表2、表3。

表2 霉变性状评分表

表3 外观成型评分表

2.1.5 结果分析 以不同工艺的因素为自变量，柚皮苷含量、新橙皮苷含量、成型性和霉变性状的标准化值为评判指标，用13.0版SPSS统计软件进行相关性和方差分析，结果见表4至表6。

表4 方差分析表(n=64)

表5 相关性分析表(n=64)

表6 变量分析表(n=64)

表4显示在炮制工艺中，温度、时间、湿度对工艺有显著影响，影响程度依次是温度＞时间＞湿度。以标准化值最高为优(表6)，最佳温度为28℃，最佳湿度为92%，最佳时间确定:柚皮苷最佳为5 d，其次是3 d，新橙皮苷最佳为5 d，其次为3 d，成型最佳为5 d，霉变最佳为4 d，时间从分值来看应是5 d最佳，但考虑到5 d时间过长，大生产时影响生产效率，且时间与柚皮苷、新橙皮苷之间不存在明显相关(表5)，此外，在实际操作中发现在温度28℃、相对湿度92%、时间为3 d时成型性和霉变性状均很好，5 d时饮片易发黑，发绿，影响外观，故最佳时间选择3 d。综合分析，樟帮枳壳的最佳工艺为A4B2C3，即温度28℃，时间3 d，相对湿度92%时工艺为佳。

2.1.6 工艺验证 另取枳壳进行了3批验证实验(结果见表7)。说明正交设计筛选出工艺可行。

表7 工艺验证实验表

2.2 樟帮枳壳炮制品工艺研究

2.2.1 试验设计 以樟帮麸炒枳壳工艺为基础，结合预试验的情况，采用L16(45)正交表对炮制温度、炮制时间、麦麸用量三因素设计试验，每因素设计四个水平，因素水平表见表8。

表8 因素水平表

2.2.2 樟帮枳壳炮制品制备 取樟帮枳壳饮片生品，依照正交设计表L16(45)进行饮片炮制。

2.2.3 柚皮苷、新橙皮苷含量测定 方法与2.1.3项下同，进行柚皮苷、新橙皮苷的含量测定。

2.2.4 色度差测定 取按正交设计表炮制的枳壳饮片5～10片，在CIE规定的标准光源条件下获取各批饮片外观的色泽信息(照片文件)。用Adobe Photoshop 9.0分别读入各批饮片外观的色泽信息数据(照片文件)，读取饮片的色泽指标数据 L、a、b值。用色差公式CIEDE 2000计算各批次饮片的色度差。

2.2.5 结果分析 以不同工艺的因素为自变量，柚皮苷含量、新橙皮苷含量标准化值饮片色度差为评判指标，用13.0版SPSS统计软件进行相关性和方差分析，结果见表9至表11。

表9 方差分析表(n=32)

表10 相关性分析表(n=32)

由表9方差分析表明:A因素、B因素、C因素各水平之间差异具有显著性(P＜0.05)。表10相关分析表明温度与柚皮苷含量存在显著负相关。以含量测定指标最高优，色度差最低优为指标(表11)，最佳温度以200℃为最佳，最佳时间以120 s为最佳，麦麸用量:柚皮苷最佳依次为10% ＞25%＞15% ＞20%，新橙皮苷最佳依次为10% ＞25% ＞15% ＞20%，色度差最佳依次为20% ＞25% ＞15%＞10%，考虑到麦麸用量为10%时饮片的色度差最大，故选麦麸用量以25%最佳。综合考虑，麸炒樟帮枳壳的最佳工艺为A3B4C4。即炮制温度为200℃，麦麸用量为25%，炮制时间为120 s。

表11 变量分析表(n=32)

2.2.6 工艺验证 另取饮片照优化工艺进行了10批验证实验(结果见表12)，说明筛选出的工艺可行。

表12 工艺验证实验表

2.3 小结 枳壳苦、辛、酸，微寒。入脾、胃经。生用作用较猛，经麸炒后，减低其刺激性，从而缓和其燥性和酸性，增强其健胃消胀的作用［3］。研究表明，枳壳中所含的柚皮苷和新橙皮苷为其主要活性成分［4］，《中国药典》2010版规定以高效液相法测定柚皮苷和新橙皮苷的含量作为枳壳药材的质量控制指标［1］。因此本实验在用正交设计安排试验时，选择柚皮苷和新橙皮苷的含量为考察指标，此外，在樟帮生品制备工艺研究时综合考查了霉变性状与成型性，在樟帮麸炒制备工艺研究时将色泽用色度差进行量化，使指标更直观准确，能较好的考察和控制炮制条件，使所确定的最佳工艺更具有实用价值。

目前对樟帮枳壳的研究，相关文献报道主要是对其炮制前后的挥发油及成分变化的研究［5－10］，尚未见对樟帮枳壳生品工艺研究的报道。现采用柚皮苷的含量、新橙皮苷含量、成型性等为考核指标，依照正交设计表L16(45)进行工艺优选，确定樟帮枳壳生品的最佳工艺为:取去内瓤的枳壳，洗净，润12 h，压扁后上木架，置温度28℃，相对湿度92%的环境中培养3 d，取出，切薄片后干燥。

［1］中国药典［S］.一部.2010:171－172.

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［4］王发英，徐 欢，杨武亮，等.枳壳质量标准研究［J］.中成药，2009，31(12):1897－1901.

［5］龚千锋，袁小平，袁艳金，等.枳壳樟帮炮制方法及其炮制前后化学成分研究［C］.中华中医药学会中药炮制分会2009年学术研讨会论文集，2009.

［6］蒋以号，龚千锋，曹旻旻，等.枳壳樟建两帮炮制前后挥发油的GC－MS分析［C］.中华中医药学会中药炮制分会2008年学术研讨会论文集，2008.

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