丹皮酚脂质体的研制及其体外释放研究

贾献慧， 唐文照， 闫 军

(1.山东省医学科学院药物研究所，山东省现代医用药物与技术重点实验室，山东济南 250062;2.济南市皮肤病防治院，山东济南 250001)

丹皮酚(paeonol)是中药牡丹皮的主要活性成分，具有抗炎、抗菌、抗变态反应、免疫调节、镇痛等［1－4］药理作用，现已广泛用于常见皮肤病治疗，能抑制黑色素细胞内酪氨酸酶的活性及黑色素的生成，对色斑、皮肤瘙痒、牛皮癣、带状疱疹、湿疹等具有较好的治疗作用［4－5］。已知剂型主要有软膏剂、贴剂、注射剂等。丹皮酚在水中的溶解度很低且易升华，见光易氧化分解，影响其使用和疗效。我们将其制成脂质体凝胶，局部涂抹治疗皮炎、湿疹等，是种新剂型。制成脂质体凝胶，因脂质体优良的生物相容性可将不易溶于水的药物包裹于其中，携带进入皮肤，增加透皮效果，并能提高药物的稳定性，增强疗效［6］。

本实验主要对丹皮酚脂质体进行研究，对丹皮酚脂质体不同制备方法进行了考察，筛选出了合适的制备方法，并对制备的的丹皮酚脂质体进行了相关研究。

1 试验材料

1.1 药品与试剂 丹皮酚(泰安中荟植物生化有限公司);大豆卵磷脂(上海楷洋生物技术有限公司);胆固醇(中国医药集团上海化剂公司);维生素E(山东省医科院药物所仲浩惠赠);丹皮酚对照品(中国药品生物制品检定所);鱼精蛋白(上海第一生化药业有限公司);CE型高精度透析袋(上海绿鸟科技发展有限公司);MeOH、CH2Cl2为分析纯;蒸馏水为新鲜自制。

1.2 仪器 AG245型电子天平(瑞士Mettler Toledu公司);R200真空旋转蒸发仪(瑞士BüCHI公司);U－3000型紫外－可见分光光度计(日本 HITACHI公司);LDZ5－2型台式低速自动平衡离心机(北京医用离心机厂);85－2型磁力加热搅拌器(金坛市江南仪器厂);ZETASIZER3000粒度分布与电势分析仪(英国Malvern公司);JEM－1200EX透射电镜(日本电子);ZRS－8G型智能溶出试验仪(天津大学无线电厂)。

2 试验方法

2.1 应用不同制备工艺制备丹皮酚脂质体［7－10］

2.1.1 薄膜－超声法 分别按处方量称取丹皮酚、大豆卵磷脂、胆固醇及维生素E，加入CH2Cl2溶解，置旋转蒸发仪上40℃减压干燥成膜。加pH 6.5磷酸盐缓冲液，振摇并超声使之分散均匀，依次过0.80、0.45 μm微孔滤膜各3次进行整粒，即得。

2.1.2 乙醇注入法 分别按处方量称取丹皮酚等脂质，加入无水乙醇超声使溶解，得到混悬液。取pH 6.5的磷酸盐缓冲液10 mL置三角烧瓶中，加入磁子，密封，置磁力加热搅拌器上搅拌，设定温度为40℃，将脂质的乙醇混悬液通过一注射针头，快速注入缓冲液中，得到悬浮液，将其依次过0.80、0.45 μm微孔滤膜进行整粒，即得。

2.1.3 乙醚注入法 分别按处方量称取丹皮酚等脂质，加入乙醚溶解。取pH 6.5的磷酸盐缓冲液置烧杯中，加入磁子，置磁力加热搅拌器上搅拌，设定温度为40℃，将脂质的乙醚溶液通过一注射针头，缓缓注入缓冲液中，得到悬浮液，将其依次过0.80、0.45 μm微孔滤膜进行整粒，即得。

2.1.4 逆相蒸发法 分别按处方量称取丹皮酚等脂质，加入CH2Cl2溶解后，加入pH6.5的磷酸盐缓冲液，振摇并超声使之分散成W/O型乳剂，置旋转蒸发仪上40℃减压蒸发除去溶剂，到达胶态后，再加pH6.5磷酸盐缓冲液，旋转蒸发使器壁上的凝胶脱落，继续减压蒸发得到混悬液，将其依次过0.80、0.45 μm微孔滤膜进行整粒，即得。

2.1.5 二次乳化法 分别按处方量称取丹皮酚等脂质，加入CH2Cl2溶解后，加入pH 6.5的磷酸盐缓冲液，振摇并超声使之分散成W/O型乳剂，再加pH 6.5的磷酸盐缓冲液，振摇并超声使之分散成W/O/W型乳剂，置旋转蒸发仪上40℃减压蒸去溶剂，得混悬液，将其依次过0.80、0.45 μm微孔滤膜进行整粒。

2.2 对各脂质体进行质量考察

2.2.1 脂质体微观形态观察 取各脂质体适量，分别用pH 6.5的磷酸盐缓冲液稀释后，滴加在有支持膜的专用铜网上，用3%磷钨酸钠溶液染色后，自然晾干，在透射电镜下观察脂质体的形态。

2.2.2 脂质体粒度分布 取各脂质体适量，分别用pH 6.5的磷酸盐缓冲液稀释后，用ZETASIZER3000粒度分析仪进行测定，应用动态光散射软件进行数据处理，记录平均粒径及多分散性指数。

2.2.3 包封率的测定 采用鱼精蛋白法考察脂质体包封率。

丹皮酚含量测定采用紫外－可见分光光度法［11］。取丹皮酚对照品5 mg，精密称定，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解、定容。分别从中精密量取0.5、1、1.5、2、2.5、3 mL 分别置 25 mL 量瓶中，定容，在274 nm处测定吸光度，绘制工作曲线，考察线性关系。

取脂质体混悬液摇匀，精密量取0.1 mL，分别置50 mL量瓶中，加甲醇溶解，测定脂质体中总药物的浓度。

取脂质体混悬液摇匀，精密量取0.1 mL，分别置于10 mL锥形离心管中，加入0.1 mL鱼精蛋白溶液(10 mg/mL)，搅匀，静置3 min，再加3 mL生理盐水，在室温条件下2 000 g离心20 min。吸取2 mL上清液，测定游离药物的浓度。

以甲醇为空白，分别取丹皮酚脂质体各样品溶液，在274 nm处测定吸收度，并计算各制备工艺脂质体的包封率(Qw%)。

综合各脂质体的特性和包封率，确定合适的制备工艺制备丹皮酚脂质体。

2.3 丹皮酚脂质体的制备及质量考察 按优选的制备工艺制备丹皮酚脂质体，进行形态观察、粒径测定并测定其包封率。

2.4 丹皮酚脂质体体外释放研究［12］

丹皮酚混悬液的制备:精密称取丹皮酚细粉(过100目)40 mg，加pH 6.5磷酸盐缓冲液10 mL，超声使成混悬液，即得。

精密量取丹皮酚脂质体及丹皮酚混悬液各3份，每份0.1 mL，分别加甲醇至5 mL，振摇使溶解;再分别从中精密取出0.5 mL，加甲醇至5 mL。以甲醇为空白，在274 nm处测定吸光度，计算药物含量。

精密量取丹皮酚脂质体及丹皮酚混悬液各3份，每份0.5 mL，分别置于面积同样大小的高密度透析袋中，固定于溶出仪的搅拌浆上，pH 6.5磷酸盐缓冲液200 mL为释放介质，37℃，100 r/m条件下进行释放试验，丹皮酚混悬液及其脂质体分别于0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、10、12、24 h 时取样，每次精密取样5.0 mL，同时补加同体积同温度的新鲜介质。将取出的样品溶液经0.8 μm滤膜滤过，即得供试品溶液。

取体外释放试验所得的样品溶液，以甲醇为空白，在274 nm处测定吸光度。计算各样品溶液中所含药物总量及释放度。

3 试验结果

3.1 不同制备工艺的脂质体质量考察

3.1.1 脂质体微观形态观察 由透射电镜照片可以看出，乙醚注入法制得的脂质体粒径差异较大，其余制备工艺所制的脂质体大多为粒径均一的圆球形结构，见图1。

图1 不同制备方法所得丹皮酚脂质体电镜图

3.1.2 脂质体粒度分布 各脂质体平均粒径及多分散性指数见表1。

表1 不同制备工艺制得的脂质体粒径分析(n=3)

3.1.3 包封率的测定 丹皮酚溶液在2.14～12.84 μg/mL内，浓度与吸收度有着良好的线性关系，回归方程为y=0.097 7x－0.002 5，r=0.999 7。各制备工艺脂质体的包封率测定结果见表2。

结果表明，薄膜－超声法、逆相蒸发法、二次乳化法制备的脂质体包封率较高。考虑到薄膜－超声法制备的脂质体形状较为圆整、大小均匀，粒径分布较为合理，包封率较高，且操作较为简单方便，决定选用薄膜－超声法来制备丹皮酚脂质体。

表2不同制备工艺制备的丹皮酚脂质体包封率(n=3)

3.2 丹皮酚脂质体的的制备及质量考察

采用薄膜－超声法制备得到丹皮酚脂质体，并进行质量考察。

脂质体混悬液呈乳白色，分散较好。由透射电镜照片可以看出脂质体大多为粒径均一的圆球形结构，见图2;其平均粒径为359.3 nm，多分散性系数为0.435 7;丹皮酚脂质体包封率为71.55%。

图2 丹皮酚脂质体电镜图(×10，000)

3.3 丹皮酚脂质体的体外释放

丹皮酚脂质体释放曲线见图3:

图3 丹皮酚脂质体和混悬液释放曲线(n=3)

可以看出，混悬液在1h时释放即接近50%，而脂质体只有20%左右的释放，脂质体明显具有缓释作用。两者在12 h时释放均达到90%左右。

4 讨论

包封率是衡量脂质体质量的一个重要指标，所以本文以包封率为主要指标来衡量不同的制备工艺。鱼精蛋白凝聚法是一种适应性较广的包封率测定方法，预试验时曾采用葡聚糖凝胶柱层析法来测定脂质体的包封率，比较繁琐、费时，后来选择鱼精蛋白法，简便快速，且重现性好。

应用薄膜－超声法制备丹皮酚脂质体，经查阅文献及预试验，曾以包封率为指标，对处方中大豆卵磷脂/胆固醇、大豆卵磷脂/丹皮酚以及维生素E用量进行了优选，得到最佳配比为大豆卵磷脂/胆固醇4∶1、大豆卵磷脂/丹皮酚10∶1、VE用量为0.1%。

报道，同时考虑到脂质体的体外释放过程比较繁琐且样品较多，故选用紫外－可见分光光度法来测定丹皮酚的含量，方法简单、方便、省时。

因磷脂结构中含有不饱和基团可以自发发生氧化，所以在脂质体处方中加入一定量的抗氧剂可以抑制自由基反应。考虑到VE除抗氧化外，还具有美白、抗衰老等功效，而我们的最终制剂是皮肤外用药，所以选择VE作为抗氧剂来抑制脂质体中磷脂等的氧化。在脂质体凝胶中则选择尼泊金乙酯作为抑菌剂，结果表明抑菌效果良好，脂质体凝胶放置半年后，无变质、变色、腐败等，稳定性良好。

参考文献:

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