烟草SSR荧光标记与毛细管电泳检测技术研究

陈雅琼，李凤霞，李锡坤，徐 军，张 磊，王绍美，孙玉合*

（1.中国农业科学院烟草遗传改良与生物技术重点开放实验室，中国农业科学院烟草研究所，青岛 266101；2.中国农业科学院研究生院，北京 10081）

烟草是我国重要的经济作物，也是生物技术研究的模式植物之一。随着分子标记技术的发展，利用DNA分子标记开展烟草的遗传多样性和亲缘关系的研究取得了一定进展[1]。最初多采用RAPD标记[2]，但是该方法存在着多态性低和稳定性差的问题，其应用受到了一定的限制。此外还有研究者采用AFLP和ISSR标记方法[3-4]。在基于PCR技术的分子标记中，simple sequence repeats（SSR，又称微卫星microsatellites）分子标记技术由于其具有多态性高、稳定性好、有高度变异、微卫星在染色体上分布均匀等诸多优点[5-8]，已成为研究烟草种质资源遗传多样性与基因组作图的首选标记。与其他植物相比，烟草 SSR标记研究起步相对较晚。直到2007年，Bindler等[9]首次报道了烟草的微卫星标记遗传图谱，总共282个微卫星标记扩增的293个SSR位点被定位到烟草24个连锁群上。

传统的 SSR操作通过聚丙烯酰胺凝胶电泳配合其他一些生物技术来进行基因的多态性分析，方法虽然成熟但耗时、耗力、非自动化，在大规模、多批次的数据收集和分析时仍存在相当大的难度，主要体现在不同等位变异难以准确识别、不同批次反应数据难以统一处理等[10]。另外一种可以用来进行基因多态性分析的手段为高效液相色谱法，但由于它的分辨率较低和成本较高而缺乏应用前景。因此，大规模的SSR研究迫切需要一种快速、准确、高效率的检测方法。

荧光标记毛细管电泳检测技术因具有高效、自动化的优点，在大麦[11]、黑麦草[12]、莴苣[13]、竹子[14]等多种植物分子标记研究中显示出极为广阔的应用前景。该法使用三引物扩增微卫星位点，采用D2、D3和D4三种不同颜色的荧光染料标记微卫星引物，将不同荧光标记、扩增片段长度差异较大的PCR 产物和标准分子量样品（内标）在同一泳道中进行电泳。通过毛细管电泳，将结果自动记录在计算机上，利用 CEQ片段分析软件进行图像收集和分析，精确计算出微卫星等位变异扩增片段的大小，实现了 SSR 标记与高效、自动化技术的结合[15]。李凤霞等[16]应用类似的技术，对烟草属内4种类型的5份栽培烟草以及28份烟草野生种进行了荧光AFLP分析，鉴定了它们的亲缘进化关系，在国内尚未见其他相关的报道。

本研究通过对9份烟草材料的SSR位点进行荧光检测分析，建立并优化毛细管电泳荧光检测技术应用于烟草SSR分子标记研究的技术体系，为实现自动化烟草遗传多样性研究提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

9份有代表性的材料选自农业部转基因烟草环境安全监督检验测试中心（青岛）（表 1）。采集营养生长期的叶片，经液氮速冻后于-70℃保存备用。

1.2 方法

1.2.1 烟草基因组 DNA 提取 采用植物基因组DNA提取试剂盒（TIANGEN，北京），按说明书分离烟草叶片的总DNA，紫外分光光度法和琼脂糖凝胶电泳法检测 DNA质量及浓度。稀释至 30～50 ng/μL，-20 ℃保存备用。

1.2.2 PCR扩增反应 PCR反应体系总体积为15 μL，其中模板 DNA（30～50 ng/μL）1.5 μL，10×reaction buffer（KCl）1.2 μL，Mg2＋（25 mmol/L）0.8 μL，dNTP（25 mmol/L）1.2 μL，TagDNA 聚合酶（5U/μL）0.2 μL，SSR 反向引物（10 μmol/L）1.2 μL，适当摩尔比例带有M13尾巴序列的特异正向引物10 μmol/L及荧光标记的通用型M13引物16 μmol/L 共 1.2 μL，ddH2O 7.7 μL。在保持其他因素一致的条件下，改变特异正向引物与M13引物的比例，筛选最优比例。PCR反应中采用的引物是从已公布的烟草 286对 SSR多态性引物中筛选出来的PT20202（表2），其扩增带型清晰、多态性高、重复稳定性好。其余试剂购自TaKaRa。

采用ABI Applied Biosystem PCR仪进行 PCR反应，反应程序为：94 ℃预变性 5 min，94 ℃变性45 s，53 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，共35个循环，最后72 ℃延伸10 min。其中，引物PT20202退火温度经温度梯度扩增筛选所得。

1.2.3 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染检测PCR扩增产物中加入3 μL 6×Loading buffer（36%甘油；0.035% 二甲苯胺蓝；30mmol/L EDTA；0.05%溴酚蓝），在 8%非变性聚丙烯酰胺凝胶上恒电压180 v电泳75 min左右。采用优化的快速银染法：0.1%的硝酸银染12 min，去离子水漂洗20 s，显影液（10 g NaOH，0.2 g Na2CO3溶于500 mL水中）显色10 min，用去离子水漂洗2遍。

表1 供试材料及类型Table1 The tested tobacco varieties

表2 SSR引物类型及序列Table2 The types and sequences of SSR primers

1.2.4 CEQ8000遗传分析系统检测 PCR产物在CEQ8000遗传分析系统（Beckman Coulter, USA）上进行SSR多态性分析。该系统采用荧光标记、毛细管电泳分离和激光诱导荧光检测技术。PCR产物稀释15倍，吸取稀释后的PCR产物作为分析样本加入样品板，每孔加入适当比例的SLS（上样缓冲液，甲酰胺）与分子量内标-400（internal standard 400）。样品板样品孔内加入半滴矿物油以防止在CEQ8000上运行时反应物蒸发，缓冲液板中对应孔内加入 3/4体积的缓冲液。选择 HUM-STR 方法（毛细管温度 50 ℃；进样 2.0 KV，30s；电泳4.8 KV，65 min）进行电泳分析。

通过检测荧光标记，所得的数据被自动收集起来，利用CEQ片段分析软件（Beckman Coulter，USA）自动统计分析数据，并将有效峰转化为“0、1”原始数据矩阵。

2 结 果

2.1 烟草SSR荧光标记与毛细管电泳检测技术体系的建立

2.1.1 PCR反应体系中M13引物与特异正向引物的摩尔比例（以下简写为M:T）的确定 为了找到M13引物与特异正向引物之间的最佳比例，利用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测作为对比进行了分析。图 1是9份烟草材料M:T分别为5:5、6:4、7:3、8:2时的扩增效果图。结果表明,带有 M13尾巴的特异正向引物过多时会有非特异性扩增产物出现（图1A1-9），过少时条带较淡（图1C 1-9及1D 1-9），且特异正向引物越少条带越淡；而当M:T=6:4时（图1B1-9），扩增条带清晰、有明显的多态性。因此可以确定M:T的最适摩尔比例是6:4。

图1 M13引物与特异正向引物不同摩尔比例对扩增效果的影响，M:T比例A为5:5，B 6:4，C 7:3，D 8:2；泳道1-9依次是9份烟草材料Fig.1 Effects of different molar ratios of M13 primer and specific forward primer on the amplification

2.1.2 上样体系中SLS、分子量内标-400及样本量的摩尔比例的确定 进行毛细管电泳分析时，分子量内标-400与SLS的比例一般不小于1:100。结果表明，加入 30 μL SLS，0.3 μL 分子量内标-400，应该加入1.0 μL 稀释后的PCR产物，这样出峰有序而且无关峰较少。为降低成本，将 SLS的用量从30 μL 减少到 25 μL、20 μL、再到 15 μL，结果发现，试验的一致性和重复性较好、体系几乎不受影响，CEQ8000遗传分析系统的稳定性亦表现良好。因而可以确定，上样体系中 SLS:分子量内标-400:样本=300:3:10，SLS 用量为 15 μL。

2.2 烟草SSR位点分析

2.2.1 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 利用引物PT20202对9份烟草材料进行扩增，扩增产物通过8%的聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测（图 1B1-9）。结果发现，这对引物的扩增产物在这些烟草材料之间存在多态性，并且扩增带型清晰，可以用于对供试材料进行基因组多态性分析。聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明，此对引物具有较好的鉴别能力，采用这种高鉴别力的引物可能用较少的引物数目就能将所有供试材料分开。

2.2.2 毛细管电泳荧光检测 采用上述所建立的技术体系，在 CEQ8000遗传分析系统上利用荧光标记毛细管电泳检测扩增产物的等位基因片段。图2为 SSR荧光标记毛细管电泳检测法对引物PT20202扩增片段进行分析的部分结果，微卫星分析结果表明，总体信号清晰，9个DNA样品电泳峰型各异，即每个DNA样品具有特异的指纹图谱，易于判断。引物PT20202扩增出的多态性片段长度在100 bp左右，而且在1个SSR位点上共检测到2个等位基因，分别是93 bp和113 bp。因此，它们可用作鉴定9个烟草材料的分子标记。

图2 毛细管电泳荧光检测G28（A）、N.sylvestris ×N.tomentosiformis（B）、N.sylvestris（C）和K326（D）微卫星标记Fig.2 The microsatellite fluorescence detection graphs of G28(A), N.sylvestris ×N.tomentosiformis(B), N.sylvestris(C) and K326(D) by capillary electrophoresis

3 讨 论

3.1 三引物对构建SSR分析体系的重要性

荧光标记引物与毛细管电泳检测相结合，可以实现对烟草SSR进行自动化分析。三引物的构成是确立CEQ8000遗传分析系统最佳技术体系的关键，也是自动化分析的前提与基础。PCR反应中所用的三种引物量的关系是：M13引物与5’端加有M13尾巴序列特异正向引物的摩尔比例通常是 1～9:1；特异正向引物与 M13引物量的加和等于普通反向引物的用量。在反应的初始阶段，带有M13尾巴的特异正向引物和普通反向引物一起特异性地扩增微卫星，当特异正向引物消耗殆尽，有荧光标记的M13引物就会代替其发挥作用，产生有标记的扩增等位基因。PCR反应体系中M:T通过影响等位基因的扩增效率，进而影响 CEQ8000遗传分析系统对SSR的多态性分析。因而，把握好体系中引物的各种比例关系是准确进行微卫星分析必不可少的。

3.2 CEQ8000遗传分析系统中上样体系对构建SSR分析体系的重要性

进行毛细管电泳分析时，上样体系中所加SLS、分子量内标-400及样本量均影响荧光检测的信号。分子量内标-400与SLS的比例一般不小于1:100；所用PCR产物的数量取决于PCR反应的效率以及扩增产物相对的信号强度，其中后者随标记染料种类的变化而变化。因此，比例适当的上样体系能够保证微卫星分析的顺利进行。此外，为了节约成本，在不影响检测效果的基础上应尽量缩小上样体系。

3.3 毛细管电泳荧光检测与银染法检测效果比较

在利用银染法聚丙烯酰胺凝胶电泳检测时，同一胶板上所有样品带谱间相对位置的识别以及不同胶板得到的 SSR数据的统一会给数据收集和分析带来很大的困难[15]。CEQ8000遗传分析系统在数据收集和处理上采用 CEQ软件分析，可以自动读出目标DNA片段的大小，将峰谱转化为0与1矩阵，进而进行计算机运算，这样不仅使工作效率大大提高，获得比银染法更多的全基因组变异信息，而且得到的数据也更加准确。

在本研究的基础上，结合毛细管电泳荧光检测技术在其他植物遗传分析中的应用，大量实验说明该技术较银染法检测效果更为理想。

3.4 多重PCR体系的建立

多重PCR技术是采用3种不同颜色的荧光染料对有相同序列的M13引物分别标记，使通过一次毛细管电泳可以进行3种以上不同微卫星标记的多重分析。这一技术体系的建立，可以有效降低成本，提高通量，使微卫星检测更为简单高效。在实际操作中，关键在于把握好通过每次毛细管电泳的等位基因片段大小要有区分。首先应该选择扩增产物差异较大的基因标记来组合多重PCR体系，以避免不同位点之间产生混淆。其次是依据峰图的高低，不断优化PCR扩增体系，通过调整模板DNA与引物的相对用量，最终得到杂带少、信号强的基因标记。

4 结 论

本研究利用毛细管电泳荧光检测技术分析烟草SSR多态性，建立了CEQ8000遗传分析系统用于烟草微卫星分析的最佳技术体系：PCR反应中，M:T＝6:4；进行毛细管电泳时，PCR产物以15倍梯度稀释、SLS:分子量内标-400:样本=300:3:10；上样体系可缩小到 SLS用量为 15 μL。将 CEQ8000遗传分析系统用于烟草 SSR分子标记研究是可行的。本研究得到的2个烟草微卫星位点，可用于区分烟草种群以及构建烟草遗传图谱。

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