RP-HPLC法测定干姜、炮姜和生姜中3种姜酚的含量

孟喜成（山西大同大学附属医院，大同市 037005）

干姜、炮姜和生姜为姜科植物姜Zingiber officinale Rosc.的根茎及其加工品，3种药用姜的功效不同，在中医临床的使用也存在一定的差异。现代药理研究表明，姜具有镇痛抗炎、抗肿瘤、抗病原体、保肝利胆、抗溃疡、改善心血管系统等多种药理作用[1～3]。姜的主要成分为挥发油和无挥发性的姜辣素类化合物，2类化合物在组方入药的过程中均能产生药理作用。以6-姜酚、8-姜酚和10-姜酚为代表的姜辣素类化合物是姜的特征性化学成分之一，研究证实姜酚具有强心、调节血管舒缩功能、抗血小板、降血脂、抗动脉粥样硬化、抗氧化与保护心肌等药理作用[4]。

目前，姜酚类成分的含量测定方法以高效液相色谱（HPLC）法为主，但以往的方法大多采用含酸的流动相体系，易使姜酚脱水形成姜烯酚，降低测定结果的准确性[5]。另外，部分方法的前处理过程需要柱层析分离等步骤，较为烦琐[6～8]。本试验采用反相高效液相色谱（RP-HPLC）法，可以在20 min内快速测定干姜、炮姜和生姜中6-姜酚、8-姜酚和10-姜酚的含量，方法简便、准确、高效，能够为药用姜的加工炮制和质量控制提供参考和依据。

1 仪器与试药

Agilent 1200型HPLC仪（美国安捷伦公司）；AW 120型电子天平（日本岛津公司）；ZN-100微型高速粉碎机（中南制药机械厂）；BRANSON 5510E超声仪（美国必能信公司）。

干姜（北京同仁堂饮片厂，批号：100520）、炮姜（北京同仁堂饮片厂，批号：100429）、生姜（购自农贸市场），经山西省药品检验所鉴定均为姜科植物姜Z.officinale Rosc.的根茎及加工品；6-姜酚（批号：E-0128）、8-姜酚（批号：E-0165）、10-姜酚（批号：E-0135）标准品（上海同田生物技术有限公司，经HPLC面积归一化法检查纯度均＞98.5%）；乙腈、甲醇为色谱纯，水为重蒸馏水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：依利特 Hypersil ODS 2（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-水（72∶28）；流速：1 mL·min-1；检测波长：280 nm；柱温：25 ℃；进样量：10 μL。在此色谱条件下，6-姜酚、8-姜酚和10-姜酚与样品中其他组分的色谱峰分离完全。色谱见图1。

2.2 标准品贮备液的制备

精密称取6-姜酚标准品11.56 mg、8-姜酚标准品10.72 mg和10-姜酚标准品10.31 mg，分别置于10 mL量瓶中，用甲醇定容，摇匀，即得标准品贮备液（6-姜酚为1.156 mg·mL-1、8-姜酚为1.072 mg·mL-1、10-姜酚为1.031 mg·mL-1），置4 ℃冰箱贮藏，备用。

2.3 供试品溶液的制备

干姜和炮姜粉碎后过4号筛，分别精密称取约0.15 g；生姜适量切成碎末，用滤纸擦干表面汁液，精密称取约0.15 g，分别置于10 mL量瓶中，加甲醇45 mL超声（功率：100 W，频率：40 kHz）处理20 min，放冷至室温，加甲醇至刻度，摇匀，过0.45 μm滤膜，取续滤液，即得。

图1 高效液相色谱图A.干姜；B.炮姜；C.生姜；D.混合标准品；1.6-姜酚；2.8-姜酚；3.10-姜酚Fig 1 HPLC chromatogramsA.dried ginger；B.baked ginger；C.fresh ginger；D.mixed standard；1.6-gingerol；2.8-gingerol；3.10-gingerol

2.4 线性关系考察

分别精密吸取“2.2”项下标准品贮备液0.1、0.5、1、10、20 mL，置于100 mL容量瓶中，加甲醇稀释，摇匀，按上述色谱条件分别进样10 μL（每份重复进样3次），测定峰面积。以标准品浓度（X，μg·mL-1）为横坐标，峰面积积分值（Y）为纵坐标，制备标准曲线，得6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚的回归方程分别为Y＝1.1377X+0.1265（r＝0.9999，n＝5）、Y＝1.1126X+0.1343（r＝0.9998，n＝5）、Y＝1.0968X+0.1564（r＝0.9999，n＝5）。结果表明，6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚的进样浓度分别在1.156～231.200、1.072～214.400、1.031～206.200 μg·mL-1范围内与各自峰面积积分值呈良好的线性关系。

2.5 精密度试验

分别取3种姜酚低、中、高3种浓度标准品溶液，连续进样3次，考察方法的日内精密度。结果，6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚峰面积的RSD分别为0.25%、0.42%、0.52%（n＝9）；再连续3 d进样，考察方法的日间精密度。结果，6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚峰面积的RSD分别为0.36%、0.63%、0.73%（n＝9），表明方法的精密度良好。

2.6 稳定性试验

精密称取干姜粉末适量，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，分别于0、1、3、6、12、24 h测定6-姜酚、8-姜酚和10-姜酚的峰面积。结果，3种姜酚峰面积的RSD分别为0.89%、1.13%、1.05%（n＝6），表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.7 重复性试验

精密称取干姜粉末适量，共6份，分别按“2.3”项下方法制备供试品溶液，测定3种姜酚的含量。结果，6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚含量的RSD分别为0.55%、0.82%、0.49%（n＝6），表明方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验

精密称取已知3种姜酚含量的干姜样品粉末适量，共6份，精密加入适量3种姜酚标准品贮备液，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件进行测定，计算加样回收率，结果见表1。

2.9 样品含量测定

精密称取干姜、炮姜和生姜样品粉末适量，分别按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按上述方法测定3种姜酚的含量，结果见表2。

表1 加样回收率试验结果（n＝6）Tab 1 Results of recovery tests（n＝6）

表2 干姜、炮姜和生姜中3种姜酚的含量测定结果（n＝5）Tab 2 Results of the content determination of 3 gingerols in dried ginger，baked ginger and fresh ginger（n＝5）

3 讨论

本试验对超声和回流等提取方法进行了比较，发现超声提取的3种姜酚成分含量要高于回流提取，分析其原因为加热回流提取会使姜酚类成分发生脱水转变，导致含量降低。另外，分别采用50%、75%和纯甲醇作为提取溶剂，发现纯甲醇对此类成分具有更高的提取效率。通过对超声提取时间的考察，发现到20 min后3种姜酚的含量不再增加，可保证提取完全。故最终选择样品提取方法为加甲醇45 mL超声处理20 min。

选择230 nm和280 nm特征波长进行比较，发现230 nm处于吸收曲线的肩峰位置，易受到干扰；选择280 nm作为检测波长，色谱图峰形较好、灵敏度高。同时，本试验比较了甲醇-水和乙腈-水流动相体系，从保留时间和分离度进行分析，结果发现乙腈-水体系的分离效果更好，3种姜酚的色谱峰与相邻色谱峰均可以达到基线分离。另外，在乙腈-水体系中添加不同浓度的冰醋酸，对色谱峰峰形与保留时间没有明显影响，故最终选择乙腈-水体系作为本试验的流动相，能够在20 min内完成3种成分的含量测定。

本方法可以为药用姜及其相关产品的质量控制和评价提供依据，为药典的含量测定方法提供有益的补充。

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