体外人工肠液激活与未激活的猪带绦虫六钩蚴差异蛋白质组学比较

王 哲，王 丹，李 巍，蔡亚楠，杨桂连，赵 权*

(1.吉林农业大学动物科学技术学院，吉林 长春 130118；2.吉林大学畜牧兽医学院，吉林 长春 130062)

猪带绦虫(Taenia solium)是常见的人兽共患寄生虫，人既是终末宿主又是中间宿主，可引起猪带绦虫或人的囊尾蚴病(囊虫病)。该病在我国北部和西部地区流行较广，给畜牧业带来一定的经济损失，并影响公共健康[1]。未激活的猪带绦虫六钩蚴经人肠液激活后变为有感染力的六钩蚴，可导致囊虫病和绦虫病，未激活的虫卵由胚膜、内胞质层、六钩蚴膜和六钩蚴等几部分组成，而六钩蚴的膜结构仅六钩蚴膜一层[2-3]，激活后虫体部分蛋白为适应新环境可能发生变化，其基因表达会因为宿主环境的刺激而有所改变，某些致病性也可能只在宿主的体内才会表现。有的蛋白质被肠液消化，而有些为适应环境而产生新的蛋白，比如热休克蛋白等。从寄生虫感染前后宿主蛋白质组的变化来研究两者的相互作用，直接发现蛋白水平的变化，更有可能找到与病原体致病性直接相关的标记物或在感染过程中发挥作用的关键因子。研究表明，激活的六钩蚴蛋白质组含7类总计65种蛋白质[4-6]。差异蛋白质通过诱导热休克蛋白，免疫相关的蛋白质和抗氧化系统的蛋白等的表达开启了正常的细胞活性向细胞保护功能的转变。差异蛋白质组研究在血吸虫和果蝇等侵入宿主机制的研究中已有应用，但至今还未见二维液相色谱分离法应用于猪带绦虫与宿主相互作用研究的报道。

ProteomeLabTMPF-2D平台的二维液相色谱技术(Two-dimensionalliquid chromatography separation，2D LC)以高效液相色谱为基础，利用一维色谱聚焦和二维反相色谱分离对生物组织细胞蛋白质组进行分离分析。2D LC技术与双向聚丙酰胺电泳(2D-PAGE)相比，具有操控简单、自动化程度高、灵敏度高、分析速度快等特点，可通过不同分离模式的偶联实现对样品中分子大小差别较大的蛋白、低含量的蛋白以及疏水蛋白的分析[4-5]。本研究应用2D LC技术，对体外模拟肠道内的激活过程和未激活的猪带绦虫六钩蚴蛋白质组进行差异分析，确定激活前后猪带绦虫六钩蚴的差异蛋白及蛋白水平的变化，并结合质谱技术确定氨基酸序列为研究猪带绦虫的寄生机制提供方法。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和仪器 二维液相色谱仪Proteme-LabTMPF-2D、ProtemeLabTMPF-2D试剂盒均为Beckman Coulter公司产品[包括高效色谱聚焦柱(HPCF-1D)、无孔硅胶反相色谱柱(HPRP-2D)、起始缓冲液(Start buffer，SB)、洗脱缓冲液(Eluent buffer，EB)、PD10 G-25脱盐柱]；PBS缓冲液次氯酸钠和硫代硫酸钠购自北京鼎国生物技术有限公司；Percoll液购自Sigma公司；新鲜猪胆汁购于长春市南关区长乐综合屠宰场；BCA法蛋白浓度检测试剂盒购自百奥公司。

1.2 猪带绦虫六钩蚴的孵化激活 成熟的猪带绦虫收集于吉林农业大学校医院患者，收集的虫卵经漂洗，加入0.75%次氯酸钠作用5 min(镜检大多数虫卵破壳)，加入0.2 mol/L硫代硫酸钠终止反应，沉淀以PBS和Percoll重悬，4℃，1600 g离心20 min，中间层为纯化的六钩蚴。参照文献[3]激活纯化的六钩蚴，同时保留未激活的六钩蚴。

1.3 激活和未激活六钩蚴可溶性蛋白提取 在激活和未激活的六钩蚴中各加入200 μL组织裂解液，4℃20000 g离心90 min，收集上清，应用BCA法测定滤液蛋白浓度，并调整浓度至3.75mg/mL。

1.4 一维色谱聚焦 一维色谱聚焦分离采用初始缓冲液平衡HPCF柱130 min，蛋白样品量为1 mg，初始缓冲液洗脱20 min，洗脱缓冲液洗脱75 min，每间隔0.3个pH单位收集1份样品，共收集样品16份于96孔深孔板内。当流出液的pH到达4.0±0.1时，依次用10倍柱体积的1 mol/L NaCl和水洗脱HPCF柱。上述过程由ProteomeLabTMPF-2D的32Karat软件自动控制。收集的样品供进一步的二维色谱分析。

1.5 二维反相高性能液相色谱 溶剂A为0.1%三氟乙酸水溶液，溶剂B为含0.08%三氟乙酸乙腈溶液。以流动相A平衡柱子10 min，每个一维收集样本进样200 μL，进行线性洗脱梯度洗脱，其中洗脱梯度为0～100%B。二维样品以0.4 min/管收集于96孔深孔板内，将分离好的样品置于-80℃保存备用，以上过程由32Karat软件自动控制进行。

1.6 PF-2D数据分析 利用Maping tools软件将由HPRP产生的数据产生的ASCII格式的文件转换成VUE格式的文件，并转换成模拟胶图，以分别展示激活和未激活的猪带绦虫六钩蚴蛋白的表达谱。

2 结果

2.1 总蛋白质提取结果 激活和未激活的猪带绦虫六钩蚴蛋白分别经PF-2D一维色谱聚焦分离，各获得9份不同pH范围的蛋白质组份，将这9个组份依次进行二维反相色谱分析，将得到的色谱数据经Maping tools软件处理，获得的模拟电泳图结果表明激活和未激活的猪带绦虫六钩蚴蛋白在表达分布主要集中在pH7.71～pH5.31值之间(图1)。

图1 PF-2D液相分离的激活和未激活的猪带绦虫六钩蚴总蛋白Fig.1 Separation of activated and nonactivatedT.soliumoncophere total proteins by PF-2D

2.2 不同pH区域蛋白质分布 从PF-2D分离得到的激活和未激活的猪带绦虫六钩蚴全部蛋白数量分布结果表明，pH值为7.71～5.31的范围内共分离出激活和未激活的猪带绦虫六钩蚴蛋白分别为208个和197个。其中，在氨基酸等电点(pI)为7.71～7.41之间的pH值区段中分离得到的未激活的六钩蚴蛋白多于激活的六钩蚴蛋白；在pI为7.41～7.11和6.81～6.51范围内的pH值区段中两者蛋白数量相同，其他pH区域均为激活的六钩蚴蛋白数量多于未激活的六钩蚴蛋白(表1)。

表1 激活和未激活的六钩蚴总蛋白的分布图Table 1 Distribution of activated and nonactivated T.soliumoncophere total proteins

2.3 不同pH区域差异蛋白质分布 激活和未激活六钩蚴全部差异蛋白总计为77个，其中激活和未激活六钩蚴分别为44个和33个。全部pH值区段分离结果显示，差异蛋白在pI约6.51～6.21和5.61～5.31之间的pH值区段中，激活和未激活六钩蚴差异蛋白数量明显(表2)。

表2 激活和未激活六钩蚴差异蛋白分布图Table 2 Distribution of activated and nonactivated T.soliumoncophere difference proteins

3 讨论

本实验研究激活和未激活的六钩蚴蛋白质差异，pH值在7.71～5.31的范围内分离获得相同蛋白164个，差异总蛋白77，激活的44个，未激活的33个，推测差异蛋白与宿主入寄生虫的适应关系，结合质谱的鉴定和相应的功能研究，从寄生虫与宿主相互作用的角度研究寄生虫的毒力因子以及与致病相关的宿主因子。

差异蛋白质组学作为一门新兴学科，目前以高效液相色谱方法(HPLC)为主的技术平台，特别是与各种质谱串联的多维色谱分离技术逐渐克服了传统固相2D技术存在的缺陷，二维液相色谱分离法包括液相状态下的色谱聚焦(第一维)及无孔硅胶反相HPLC分离(第二维)。从第二维洗脱的蛋白质可用电喷雾离子阱质谱(ESI-MS)直接检测，或用基质辅助激光解吸质谱(MALDI-MS)测定分离蛋白的完整分子量。二维液相色谱技术作为蛋白质组分离技术的一种重要补充，近年来在国内外应用广泛[7]。PF2D比普通2D电泳优势明显，已经逐步作为分离蛋白质的主导地位，具有灵敏度高上样量大自动化高等特点[8]，而二维液相色谱分离系统可在溶液状态下实现完整蛋白质的分离和收集[9]。而且二维色谱分离可直接与质谱串联。在获得所有完整蛋白质pI/UV同谱的同时可得到高精确的质量图谱[10]。本研究通过ProteomeLabTMPF-2D目标蛋白快速分离系统来对激活和未激活六钩蚴的差异蛋白质组学进行了初步研究，并得到了差异蛋白质组图谱，为猪带绦虫六钩蚴与宿主关系的研究提供试验方法。

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