紫外分光光度法测定毛鸡骨草提取物中总黄酮含量*

王丽丽，杜慧斌，叶志文，张晓琦，汪 豪,**，叶文才,

1中国药科大学 天然药物化学教研室,南京 210009；2广西玉林制药有限责任公司，玉林537001；3暨南大学 中药及天然药物研究所，广州 510632

毛鸡骨草为豆科相思子属植物Abrus mollis Hance的干燥全草。本品具有清热利湿、舒肝止痛、活血散瘀的功效，临床用于治疗急慢性肝炎、肝硬化腹水、胃痛、风湿痹痛等症[1]。毛鸡骨草，又名大叶鸡骨草，为广西特产药材，是中药名优产品鸡骨草胶囊的主要原料。本课题组药效物质基础研究表明，广西毛鸡骨草治疗肝病的主要药效活性成分为芹菜素黄酮碳苷类化合物，即芹菜素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷等，毛鸡骨草提取物是从毛鸡骨草提取分离得到的总黄酮碳苷有效部位，该类化学成分具有保肝、降酶及降脂等药效活性[2-3]。《中国药典》2005年版一部未收载药材鸡骨草及含鸡骨草制剂的含量测定方法。本文采用紫外分光光度法，以三氯化铝为显色剂，芹菜素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷为对照品（结构式见图1），测定毛鸡骨草提取物中总黄酮含量，从而为其成方制剂的质量标准化研究提供依据。

图1 芹菜素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷的结构式

1 仪器与试药

UV-2450型紫外可见分光光度计（日本岛津）；Mettler Toledo XS105DU十万分之一电子天平 （瑞士 Mettler Toledo）；PHS-3C 精密 pH 计(上海雷磁)。毛鸡骨草提取物系毛鸡骨草经大孔吸附树脂工艺分离纯化得到；芹菜素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷为中国药科大学天然药物化学教研室自制，对照品纯度＞98%(HPLC-UV法,面积归一化法)[4]。其他所用试药与溶剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

对照品溶液：精密称取芹菜素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷适量，加甲醇制成0.20 mg·mL-1的溶液，即得。

供试品溶液的制备：取毛鸡骨草提取物约10mg，精密称定，置25mL量瓶中，加甲醇10 mL超声使溶解，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

显色试剂和缓冲液的配置：精密称取三氯化铝1.34g，加甲醇溶解并定容至100mL，配成0.1mol·L-1的溶液；精密称取醋酸钠1.64g，加双蒸水溶解并定容至100 mL，配成0.2mol·L-1的溶液；精密量取1.15mL冰醋酸，加双蒸水稀释至100mL，配成0.2mol·L-1的醋酸溶液[5]。

2.2 测定波长的选择

精密量取芹菜素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷对照品溶液1 mL置25 mL量瓶中，加入2 mL 0.1 mol·L-1的三氯化铝溶液与2 mL pH5.2的醋酸钠/醋酸缓冲液，各加甲醇稀释至刻度，摇匀，40°C水浴10min，室温放置10min，同法制得供试品溶液和空白液，按紫外-可见分光光度法（《中国药典》2005年版一部附录VA）试验，在200～500 nm范围内进行扫描，记录紫外吸收光谱，见图2。

图2 对照品（A）和供试品（B）显色前后的紫外吸收光谱

结果表明，对照品和供试品溶液显色后均在343、382nm处分别有最大吸收，但两种溶液显色前382nm处的吸收度均较小，故选择382nm为测定波长。

2.3 线性关系考察

精密量取芹菜素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷对照品溶液 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL，余同“2.4”项操作，在382 nm波长处测定吸光度，以对照品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，回归方程为：Y=0.0229X-0.0012,r2=0.9999。结果显示，对照品在 4.1～24.6 μg·mL-1范围内线性关系良好。

2.4 重复性试验

取本品同一毛鸡骨草提取物6份，按“2.4”项下方法操作并计算含量，含量均值为74.2%，RSD=2.12%，表明本法重现性较好。

2.5 加样回收率试验

精密称取已知含量的毛鸡骨草提取物5份 （总黄酮含量：74.2%），各精密加入芹菜素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷对照品适量，制备供试品溶液并按“2.4”项下方法操作，计算加样回收率，回收率均值为101.3%，RSD=2.6%。结果见表1，表明本法准确度较好。

2.6 样品测定

取本品毛鸡骨草提取物5批样品，按“2.4”项下方法操作并计算含量，结果见表2。

3 讨 论

黄酮类化合物分子中含有 3-羟基-4-酮基、5-羟基-4-酮基或邻二酚羟基等基团时可以与铝盐络合，并引起相应的吸收带红移。毛鸡骨草提取物中的主要活性成分为芹菜素黄酮碳苷类化合物，该类化合物的5-羟基-4-酮基与铝盐络合，显色后在382 nm处有最大紫外吸收，且显色前的背景吸收度较小，可以避免非黄酮类化学成分的测试干扰。单因素考察不同显色剂用量 （0.1 mol·L-1三氯化铝1.0、2.0、4.0 mL），显色温度（30、40、50℃），缓冲液pH（5.0、5.2、5.4、6.0），以“2.4”项采用的条件最好。本测定方法简便、准确，专属性较强，适用于毛鸡骨草提取物及含毛鸡骨草制剂的总黄酮含量测定。

表1 加样回收率试验

表2 毛鸡骨草提取物总黄酮含量测定结果(n=3)

[1] 《中华本草》编委会.中华本草[M].第4卷.上海:上海科学技术出版社,1999:303-5.

[2] 刘卓伟，阙兆麟，叶志文，等.毛鸡骨草地上部分的化学成分[J].中国天然药物，2008，6(6):415-7.

[3] 汪 豪，熊 非，刘卓伟，等.黄酮碳苷类化合物在治疗和预防肝炎药物中的应用[P].中国，200710134589.4.2008-04-16.

[4] 宁丽娟，汪 豪，叶文才，等.毛鸡骨草中芹菜素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷对照品的制备分离及鉴定[J].

中草药，2010，41(8):1905-7.

[5] 丁明玉，赵纪萍，李擎阳.贯叶金丝桃提取物中总黄酮的测定方法[J].分析实验室，2001，20(6):45-7.