MRPL48基因在代谢综合征诊断中的意义探讨

孙鲁宁，张 宁，宋晓宇，郑宁宁，张海鹏

代谢综合征 (metabolic syndrome，MS)是各种代谢危险因素在同一个体中簇集的状态，以中心性肥胖、高血糖、血脂异常、高血压等聚集发病为特征。近年来，MS发病率在全球呈迅速上升趋势，欧美等国家MS已累及成年人口的1/4［1］;中华医学会糖尿病分会的一项最新调查结果显示，我国MS的总体患病率为13.7%［2］。目前诊断MS的标准主要是依据患者的血生化检测结果制定的，因患者的个体差异很大，仅凭血生化检测结果往往不足以反映机体的整体代谢状况。若能从MS的发病机制入手，在基因或蛋白质水平上找到更加理想的特异性诊断标准，无疑会对MS的临床诊治产生重要的意义。

线粒体是细胞代谢网络的中心枢纽，它在细胞代谢过程中起着重要作用。近十多年来，线粒体功能与MS的关系正逐渐受到关注。线粒体核糖体负责线粒体基因 (mtDNA)编码蛋白的翻译，其异常会引起线粒体膜电位下降和能量产生不足，从而引起体内的各种代谢障碍，进而导致MS的发生。基于此，本研究采用RNA干扰的方法抑制Hela细胞线粒体核糖体大亚基蛋白48(mitochondrial ribosomal proteins，MRPL48)基因的表达，观察线粒体膜电位的改变，从而明确MRPL48在维持机体能量代谢中的作用，并进一步探讨MRPL48在MS临床诊治中的意义。

1 材料与方法

1.1 材料 GIBCO®DMEM培养液、胎牛血清 (Invitrogen公司);MRPL48 shRNA质粒 (Open Biosystems公司);LipofectamineTM2000转染试剂 (Invitrogen公司);WST-1细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒 (博士德公司);MRPL48抗体(Abcam公司);辣根过氧化物酶标记的兔抗人二抗 (Sant Cruz公司);硝酸纤维素膜 (Bio-Rad公司);线粒体荧光染料JC-1(Molecular Probes公司)。

1.2 方法

1.2.1 Hela细胞培养 向含10%胎牛血清的DMEM培养液中加入100 U/ml青霉素和100μg/ml链霉素，在7.5%二氧化碳(CO2)培养箱中培养 (37°C)。

1.2.2 病毒包装和转染 将PA317细胞接种于6孔板，待其长满约80%时，使用转染试剂LipofectamineTM2000将pLNCX逆转录病毒表达载体和shMRPL48转入PA317细胞，6 h后换液，24 h后收集病毒并转染Hela细胞。

1.2.3 Western blotting方法检测MRPL48的表达 取40μg蛋白10%SDS-PAGE电泳后转印至硝酸纤维素膜上。用含5%脱脂奶粉的封闭液封闭该膜37℃ 1 h，再加入MRPL48抗体(1∶500)4℃孵育过夜。经ECL显影后，用电泳凝胶成像分析系统 (Chemiimager 5500 ALPHA INNOTECH U.S.A)分析光密度值。

1.2.4 JC-1染色法观察线粒体膜电位的变化 线粒体将产生的能量以电化学位能储存于线粒体内膜，称为线粒体膜电位，其变化可作为反映线粒体能量代谢改变的敏感指标。通过JC-1从红色荧光到绿色荧光的转变可以检测到线粒体膜电位的下降。分别收集3×105RNA干扰组和对照组Hela细胞，加入0.5 mg/ml JC-1溶液，37°C避光静置20 min后，用PBS缓冲液清洗细胞2次，用荧光显微镜观察线粒体膜电位变化。

2 结果

2.1 RNA干扰组和对照组Hela细胞MRPL48蛋白表达 电泳凝胶成像分析系统分析光密度值显示:RNA干扰组Hela细胞MRPL48蛋白表达较对照组减少58%(见图1)，说明shRNA能有效抑制Hela细胞MRPL48蛋白的表达，从而实现基因沉默效应。

图1 Western blotting检测RNA干扰组和对照组Hela细胞MRPL48的表达Figure 1 Expression of MRPL48 in RNA interference Hela cells and the control by Western blotting

2.2 线粒体膜电位的变化 JC-1染色显示，对照组Hela细胞线粒体染色后呈现红色荧光颗粒，RNA干扰组Hela细胞线粒体绿色荧光颗粒明显增加 (见图2)，提示线粒体膜电位下降。

图2 RNA干扰组和对照组Hela细胞线粒体膜电位改变 (JC-1染色，×40)Figure 2 Mitochondrial membrane potential changes of RNA interference Hela cells and the control(JC-1 staining， ×40)

3 讨论

MS是由于先天的遗传因素与后天的环境因素共同作用引发的一系列临床、生化和体液代谢失常，从而引起糖类、脂类和蛋白质等多种物质代谢异常的综合征［3］。因其发病率正逐年增高，且严重威胁人类健康，已在世界范围内受到广泛的关注。目前临床上比较常用的MS诊断标准主要有3种，分别为2001年美国国家胆固醇教育计划成人治疗组第三次指南(NCEP-ATPⅢ)标准［4］，2005年国际糖尿病联盟 (IDF)标准［5］，以及中华医学会糖尿病学分会根据中国人MS的研究，在2004年提出的诊断标准 (CDS标准)［6］。上述3种诊断标准尽管存在一定的差异，但均是主要依据患者的临床生化检测结果制定的。不同的诊断标准检出的MS临床患病率差异较大，并且受到年龄、民族、种族、性别等多因素的影响，这就给MS的临床诊治带来了一定的困扰［7］。故本研究试图从MS的发病机制入手，在基因或蛋白质水平上找到更加理想的特异性诊断标准。

线粒体是细胞代谢网络的中心枢纽，涵盖和控制着约189条生化代谢系列反应，包括呼吸氧化、糖酵解、脂肪酸氧化、三羧酸循环、磷脂合成、蛋白质跨膜转运路径等。所有糖类、脂类及蛋白质代谢的最后阶段都在线粒体内经三羧酸循环完成氧化。因而，Saris等［8］提出:所有代谢障碍最终均可归因为线粒体的功能异常。线粒体也是哺乳动物细胞内惟一含有核外遗传物质的细胞器，线粒体基因 (mtDNA)全长仅为16.6 kb(核基因组全长为30亿kb)。mtDNA的表达异常可造成线粒体电子传递障碍，引起线粒体的能量代谢障碍，进而参与神经退行性疾病、糖尿病、肿瘤等的发生［9-10］。线粒体核糖体负责翻译13种mtDNA编码蛋白。作为线粒体核糖体活性中心的线粒体核糖体蛋白 (mitochondrial ribosomal proteins，MRPs)是mtDNA正常表达的基础。它由核基因编码，在细胞质中的核糖体上合成，然后转运到线粒体中，参与线粒体基因的表达［11］，其结构和功能异常可能会影响mtDNA编码蛋白的合成，使参与代谢的辅酶数量减少或活性降低，并使线粒体氧化磷酸化效率降低，导致糖类、脂类等物质代谢紊乱，同时使ATP产生减少，后者可进一步促进代谢紊乱的发生发展。近年来，人类线粒体核糖体全部78个组成蛋白编码基因的序列及染色体定位均已明确，使我们对MRP的进一步研究有了可能。我们的前期研究结果已证明，并非所有的MRPs异常都会引起严重的代谢障碍［12］。因而，从78种MRPs中鉴定出影响线粒体代谢功能的关键蛋白，对于从分子水平上明确MS的诊断具有尤为重要的意义。

基于上述设想，本研究采用RNA干扰的方法抑制Hela细胞MRPL48的表达，观察到细胞线粒体膜电位下降等损伤性改变，提示此时细胞内发生了代谢障碍。也就证实了MRPL48是影响线粒体功能的关键蛋白质，该蛋白在细胞代谢过程中起到了非常重要的作用。MRPL48基因表达减少可能正是在MS患者在分子水平上的特异性变化。若上述设想得到证实，MRPL48将有望作为MS临床诊治的新靶点。今后，我们将继续开展MS动物模型的研究，以便进一步提供相关的理论和实验依据。

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3 赵峥.代谢综合征的研究进展 ［J］.实用心脑肺血管病杂志，2011，19(1):143.

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6 中华医学会糖尿病学分会代谢综合征研究协作组.中华医学会糖尿病学分会关于代谢综合征的建议［J］.中华糖尿病杂志，2004，12(3):156-161.

7 任路平，宋光耀.高果糖饮食与代谢综合征研究新进展 ［J］.中国全科医学，2011，14(4):1278.

8 Saris WH，Heymsfield SB.All metabolic roads lead to mitochondrial(dys)-function ［J］.Curr Opin Clin Nutr Metab Care，2007，10(6):661-663.

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10 Kloss-Brandstätter A，Schäfer G，Erhart G，et al.Somatic mutations throughout the entire mitochondrial genome are associated with elevated PSA levels in prostate cancer patients ［J］.Am J Hum Genet，2010，87(6):802-812.

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12 O'Brien TW，Wang RL，Sun LN.Specialized ribosomes in mammalian mitochondria.Mitochondrial Medicine.2010.Scottsdale， Arizona， U-nited States.