泌尿生殖道沙眼衣原体临床株体外药物敏感性检测及分析

吴志周 祝 新 杨日好 柯建良 黄澍杰

广东省江门市皮肤医院 529000

泌尿生殖道沙眼衣原体的感染是世界范围内最常见的性传播疾病之一,其感染率在我国也有逐年上升的趋势[1]。沙眼衣原体是一种严格细胞内寄生的病原体,相对于普通细菌和支原体,其药敏试验较为复杂,给临床监测其耐药性带来困难。近年来由于抗生素的滥用和使用不规范,导致沙眼衣原体对多种抗生素耐药性增加,疗效下降。有关沙眼衣原体临床株耐药的报道日益增多[2～4],涉及的抗生素主要有大环内酯类、四环素类和喹诺酮类。为了解本地区沙眼衣原体临床株的药物敏感性情况,笔者进行了本次实验。

1 材料

1.1 病例来源 2010年8月-2011年5月我院性病门诊就诊的有泌尿生殖道炎症症状的患者。

1.2 标准株 沙眼衣原体D型标准株和McCoy细胞株由中山医科大学微生物教研室惠赠。

1.3 细胞生长培养基 细胞生长培养基为RPMI 1640(美国Gibco公司)培养基,用前补充谷氨酰胺(0.1%)、HEPES(0.25%)、Na2CO3(0.2%)、小牛血清(10%)以及适量的万古霉素、庆大霉素、两性霉素B等。

1.4 衣原体生长培养基 在细胞生长培养基中添加放线菌酮(0.1%)、葡萄糖(0.5%)。

1.5 抗菌药物 强力霉素、四环素、阿奇霉素、交沙霉素、红霉素、克拉霉素、左氧氟沙星和司帕沙星均购自上海生物制品检定所。抗菌素按照试剂说明书溶解后,用1640培养基稀释到一定浓度后分装,-70℃冻存备用。

1.6 主要器材 96孔U型板、细胞培养瓶、CO2培养箱。

2 方法

2.1 临床菌株培养 将男性尿道、女性宫颈拭子,接种到McCoy单层细胞株上,培养筛查出阳性标本,并增殖传代至一定浓度(每ml约7.8×106沙眼衣原体包涵体)后保存在蔗糖谷氨酸磷酸盐缓冲液(SPG),作为临床待检株。

2.2 McCoy单层细胞的培养 将细胞培养瓶中已培养成单层的McCoy细胞消化洗脱后移种于96孔U型板中,并于各孔中加入适量的细胞生长培养基,置37℃、5%CO2环境中培养24h,使之成为致密单层细胞[每孔含(1～2)×105细胞]。

2.3 药物敏感性测定 向已培养成致密单层Mc-Coy的96孔U型板中接种沙眼衣原体(4×104包涵体),3 000r/min、30℃离心 1h,置 37℃、5%CO2环境中培养2h,然后弃去上清液,加入衣原体生长培养基。设置第1孔为阳性对照孔(接种沙眼衣原体,但不加药),第8孔为阴性对照孔(不接种沙眼衣原体,但加药),从第2孔开始加入已配制好的相应待测抗菌药物,依次倍比稀释至第7孔,使抗菌药物形成6个等比稀释浓度,D型标准株作对照,37℃、5%CO2环境中培养48～72h。弃去96孔U型板中的维持生长培养基,风干并用丙酮固定后,用碘染色,镜下观察未见沙眼衣原体包涵体生长的最小稀释度即为该药物对沙眼衣原体的MIC。

3 结果

本文将收集到的100例临床阳性株进行传代,共培养出符合要求(McCoy细胞感染率达90%以上)沙眼衣原体阳性株73株。MIC值分别为:强力霉 素 0.016 ～ 0.125μ g/ml、四 环 素 0.039 ～0.625μ g/ml、阿奇霉素 0.032～ 1μ g/ml、交沙霉素0.005～ 0.16μ g/ml、红霉素 0.125 ～ 2μ g/ml、克拉霉素 0.004～ 0.064μ g/ml、左氧氟沙星 0.063～1.0μ g/ml、司帕沙星 0.032 ～ 0.256μ g/ml。 详细结果见表1。

表1 73株沙眼衣原体临床标本药敏结果

4 讨论

目前,国内外尚无规范的沙眼衣原体体外药敏结果判定标准,临床上针对沙眼衣原体的治疗主要根据推荐方案及经验用药[5],缺乏药敏试验指导用药,不同地区的菌株对药物的敏感性也不尽相同。为给临床用药提供理论依据,并评价药敏结果与临床疗效的关系,本试验选取本院用于治疗沙眼衣原体感染的几种常用抗菌药物进行药敏试验,结果显示克拉霉素及阿奇霉素有较强的抗菌活性,强力霉素次之,红霉素和左氧氟沙星的抗菌活性则较低。

笔者在试验中发现,沙眼衣原体临床株对所有受试抗菌药物均表现出一定的敏感性,未发现耐药株。与国内韩建德和邵丽丽的报道一致[6,7]。而在国外,笔者检索了近几年的文献,Samra在体外测定50例泌尿生殖道沙眼衣原体对四环素药物的敏感性,发现 44%的菌株0.5μ g/ml时被抑制[2],表明对四环素的抵抗相当严重;Misyurina对4例患者的6株沙眼衣原体标本进行研究,发现其中4株对阿奇霉素耐药[3];Somani报道了多重耐药(耐多西环素、阿奇霉素及氧氟沙星)的沙眼衣原体株[4]。本次实验结果表明左氧氟沙星、红霉素和司帕沙星的MIC值较高,沙眼衣原体对这些药物的敏感性低,与韩建德报道的MIC值有明显的提高[6],提示随着喹喏酮类抗菌素的广泛使用,其抗沙眼衣原体的活性明显降低,这与笔者在临床上观察到的这些药物在治疗沙眼衣原体感染时失败的病例日益增多相符合。阿奇霉素是推荐方案中的首选药物,本文检测结果与尚淑贤的报道相一致[8],均有较强的抗菌活性。阿奇霉素、克拉霉素是新的大环内酯类,对沙眼衣原体具有较低的抑菌和杀菌浓度,有效的血药浓度为0.400～ 0.450μ g/ml。本实验显示,沙眼衣原体对阿奇霉素及克拉霉素具有高度敏感性,两者的MIC均低于常规用药时的血药浓度,有较强的抗菌活性和杀菌作用,与临床上用这些药物在治疗沙眼衣原体感染成功率相一致。因此,笔者认为阿奇霉素及克拉霉素是临床上治疗泌尿生殖道沙眼衣原体感染的首选药物。

[1] 徐丽玲,顾伟鸣,杨阳,等.1996～2003年上海市某医院泌尿生殖道分泌物标本性病检测结果分析〔J〕.中国艾滋病性病,2005,11(2):121-124.

[2] Samra Z,Rosenberg S,et al.In vitro susceptibility of recent clinical isolates of Chlamydia trachomatis to macrolides and tetracyclines〔J〕 .Diagn Microbiol Infect Dis,2001,39(3):177.

[3] Misyurina OY,Chipitsyna EV,Finashutina YP,et al.Mutations in a 23S rRNA gene of Chlamydia trachomatis associated with resistance to macrolides〔J〕.Antimicrob Agents Chemother,2004,48(4):1347-1349.

[4] Somani J,Bhullar VB,Workowski KA,et al.Multiple drug-resistant Chlamy dia trachomatis associated with clinical treatment failure〔J〕 .J Infect Dis,2000,181(4):1421-1427.

[5] 王千秋,张国成,主编.性传播疾病临床诊疗指南〔J〕.上海科学技术出版社,2007,5(1):30.

[6] 韩建德,陈木开,廖绮曼,等.生殖道沙眼衣原体对几种抗菌药物敏感性的研究〔J〕.中华皮肤科杂志,2006,39(10):559-561.

[7] 邵丽丽,江勇,杨丽娜,等.299例泌尿生殖道沙眼衣原体的检测及药物敏感性分析〔J〕.临床皮肤科杂志,2010,39(3):141-143.

[8] 尚淑贤,钟铭英,张津萍,等.沙眼衣原体临床株体外药物敏感性检测〔J〕.中华皮肤科杂志,2007,40(12):759-760.