志贺菌临床株耐药性分析及对氟喹诺酮类抗生素耐药机制的研究*

梁 帆 程玉谦 张 娜 王 俊 王淑香 郭文学 祁 伟

志贺菌是细菌性痢疾（菌痢）的病原体，是影响全球公共卫生的重要问题。上世纪70年代以来，随着抗生素的广泛应用，耐药菌及多重耐药志贺菌逐渐增多。本研究对天津地区2009—2010年分离出的志贺菌临床株进行耐药性分析，并对氟喹诺酮耐药菌株的耐药机制进行深入研究。

1 材料与方法

1.1 菌株及来源 收集分离自天津地区多家三级甲等医院2009—2010年肠道门诊患者粪便标本的志贺菌119株。经常规生化及血清凝集试验证实，包括福氏志贺菌19株，宋内氏志贺菌 99株，鲍氏志贺菌 1株。qnrA、qnrB、qnrS、aac（6′）-ib-cr阳性菌株为本研究所保存，质粒接合试验所用受体菌大肠埃希菌J53 AZR由上海复旦大学王明贵教授惠赠。

1.2 培养基及药敏纸片 水解酪蛋白（MH）琼脂购自上海伊华生物科技有限公司。药敏纸片包括庆大霉素、链霉素、四环素、复方磺胺甲口恶 唑（SMZco）、阿米卡星、痢特灵（呋喃唑酮）、氨苄西林、头孢哌酮舒巴坦、头孢曲松、头孢噻肟、头孢他啶、亚胺培南、萘啶酸、环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星及左氧氟沙星共17种，购自北京天坛生物制品研究所。引物合成及PCR产物测序由北京六合华大基因技术有限公司完成。

1.3 方法

1.3.1 抗菌药物敏感试验 所有菌株严格按照CLSI2010标准，采用改良Kirby-Bauer纸片扩散法进行检测。并对qnr、aac（6′）-ib-cr及qepA阳性供体菌、受体菌、接合菌采用微量肉糖稀释法测定抗生素最低抑菌浓度（MIC）,质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922。

1.3.2 细菌总DNA的提取 采用煮沸法提取细菌总DNA作为PCR反应的扩增模板[1]。

1.3.3 氟喹诺酮耐药菌gyrA、parC基因突变的检测 引物gyrAF/gyrAR[2]、parCF/parCR[3]分别扩增gyrA、parC 基因片段，见表1。反应体系为25 μL，取PCR反应产物1%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，凝胶系统下观察结果。对PCR反应产物测序，结果经blast程序与GenBank数据库公布的标准菌序列进行比对，分析gyrA、parC基因突变位点及数目与氟喹诺酮耐药性的关系。

表1 PCR扩增反应引物序列及特征

1.3.4 qnrA、qnrB、qnrS、aac（6′）-ib-cr和qepA的基因检测及序列分析 所有菌株采用PCR扩增qnrA、qnrB、qnrS、aac（6）′-ib-cr和qepA基因片段，反应引物设计参考文献[4-5]，见表1。对PCR反应产物测序，结果经blast程序与GenBank数据库公布的标准菌序列进行比对，进一步确定基因型。

1.3.5 质粒接合试验 以喹诺酮耐药基因（PMQR）阳性菌为接合试验供体菌，参照Wang等[6]的方法，以耐叠氮化钠的大肠埃希菌E.coli J53（Azide resistant）为受体菌，采用滤膜结合法进行接合试验。取对数生长期的供体菌1.0 mL及受体菌0.5 mL菌液在1.5 mL的Eppendorf管中离心，重新悬浮后转种到预热好的LB琼脂平板滤膜上，35℃孵育4~6 h，接合子以含复方磺胺甲口恶 唑（300 mg/L）和叠氮化钠（100 mg/L）的LB琼脂平皿上筛选，置于35℃孵育18~24 h，微量肉汤稀释法测定供体菌、受体菌、接合菌的MIC值。

1.3.6 质粒抽提 参照文献[7]方法，提取供体菌、受体菌、接合菌质粒DNA。对接合菌的质粒DNA进行相对应耐药基因的PCR扩增，产物进行序列测定。

2 结果

2.1 药敏试验结果 见表2、3。志贺菌对一代喹诺酮萘啶酸敏感率最低，其次是氨苄西林、复方磺胺甲口恶唑和四环素，3种及3种以上抗生素多重耐药菌株接近98%。对三代头孢菌素药物敏感率高，未发现亚胺培南及头孢哌酮舒巴坦耐药株。对氟喹诺酮类药物耐药率低于5%，左氧氟沙星耐药率低于2%。5株氟喹诺酮耐药菌均为福氏志贺菌，宋内氏志贺菌对萘啶酸耐药率高，未出现氟喹诺酮耐药菌。

表3 5株氟喹诺酮耐药福氏志贺菌药敏结果[抑菌环直径（mm），耐药性]

2.2 gyrA、parC基因扩增结果及序列分析 5株耐氟喹诺酮志贺菌全部扩增出gyrA和parC片段，片段长度分别为648、469 bp，琼脂糖凝胶电泳呈现均一条带，且与目的片段大小相等，见图1。对PCR产物进行测序，与GenBank标准菌株Blast比对，4株同时存在gyrA83、87位点及parC80位点突变，1株缺乏gyrA87位点突变，见表4。另有菌株3171 gyrA 176位点GTA（His）➝GGA（Pro）突变，但位于QRDR区外。

图1 部分氟喹诺酮耐药志贺菌gyrA、parC基因扩增电泳图

表4 5株氟喹诺酮耐药志贺菌基因突变

2.3 qnrA、qnrB、qnrS、aac（6′）-ib-cr和qepA基因扩增结果及序列分析 119株志贺菌3株携带qnr基因和（或）aac（6′）-ib-cr基因，其中1株携带qnrS1基因；2株携带aac（6′）-ib-cr基因。未检测出qnrA、qn⁃rB、qepA基因。5株经PCR检测出现560 bp的预期条带，经测序有2株存在304位（T→C）、535位（G→T）位点突变，确定为aac（6′）-ib-cr基因阳性株。PCR扩增qnrS、aac（6′）-ib-cr基因电泳图，见图2。

2.4 PMQR基因阳性菌株质粒接合试验 3株PMQR阳性菌株中N8、F8质粒结合试验接合转移成功，J53接合前后受体菌及接合子的药敏结果变化，见表5。碱裂解法提取供体菌、受体菌、接合子质粒DNA，纯化并进行对应PMQR基因PCR扩增，均可扩增出目标片段，见图2，测序与供体菌携带的PMQR基因序列完全一致。

表5 大肠埃希菌J53 AZR与N8、F8质粒接合前后的MIC值变化

图2 PMQR基因阳性菌株及接合菌PCR扩增产物电泳结果

3 讨论

志贺菌痢疾发病率已由1980年的8%~12%降至2008年的3%[8]，但其耐药率尤其是多重耐药率却逐渐上升。本研究结果显示近2年天津地区志贺菌痢疾的流行菌型已由福氏转变为宋内氏为主，与国内其他地区的报道类似[9]。药敏结果显示，本地区志贺菌对临床常用抗菌药普遍耐药，对萘啶酸、氨苄西林和复方磺胺甲口恶唑的敏感率均低于5%，对阿米卡星、呋喃唑酮敏感率相对较高。5株氟喹诺酮耐药菌均为福氏志贺菌，耐药率为4.2%。对三代头孢敏感率均高于90%，未出现加酶抑制剂类及碳青霉稀类抗生素耐药菌。

志贺菌对喹诺酮类药物的耐药机制主要包括染色体介导耐药和质粒介导耐药，其中染色体介导的靶位酶基因突变占主导地位。DNA解旋酶是主要作用靶位，但要形成显著耐药，拓扑异构酶Ⅳ基因也必须同时发生变异，且突变数目越多、范围越大，耐药程度也越高，尤其是涉及第2靶酶ParC[10]。本研究中5株氟喹诺酮耐药菌耐药程度均较高，其中N8、F44对3、4代氟喹诺酮类药物同时耐药。耐药菌在gyrA、parC基因均有突变，突变株中均有gy⁃rA83（Ser→Leu）及parC80（Ser→Ile）位点突变，其中左氧氟沙星耐药株N8与其余4株菌相比缺乏gyrA基因87位点突变，但携带质粒介导喹诺酮耐药基因qnrS1，分析其对左氧氟沙星的耐药性可能与之相关。其余4株菌均同时存在gyrA87（Asp→Gly、Asn）位点突变，但只有F44表现出对左氧氟沙星耐药。此外，本研究药敏结果显示，菌株3171、1113、4536具有相同的基因突变表型，但对诺氟沙星和左氧氟沙星的耐药程度不同，考虑存在如外排泵基因过表达等其他机制协同作用，具体原因有待进一步研究。另有菌株3171 gyrA 176位点GTA（His）➝GGA（Pro）突变，但位于QRDR区外，与氟喹诺酮类药物耐药的相关性也有待进一步证实。

PMQR主要介导低水平耐药，是对靶位酶突变机制的补充，但其可以借助可移动元件如整合子与ISCR等通过质粒接合、转化等传递方式在不同菌株甚至不同菌群之间传播，导致耐药的广泛播散。志贺菌中质粒介导喹诺酮耐药基因包括qnrA、qnrB、qnrS、aac（6′）-ib-cr及qepA，不同地区检出率不同。本研究共检出3株PMQR基因阳性株，qnrS1阳性菌N8为福氏志贺菌，对氟喹诺酮耐药；aac（6′）-ib-cr基因阳性菌均为宋内氏志贺菌，对氟喹诺酮敏感。N8及aac（6′）-ib-cr阳性菌F8成功通过质粒接合试验将耐药基因转移到受体菌中，qnrS1及aac（6′）-ib-cr基因分别使受体菌对环丙沙星、氧氟沙星及左氧氟沙星的MIC增加了16、8、16倍及4、4、2倍，但都达不到临床意义的耐药临界值，进一步印证了PMQR基因介导低水平耐药的推断，并提示qnr介导喹诺酮耐药程度要高于aac（6′）-ib-cr。在gy⁃rA、parC双基因双位点突变的基础上，qnrS1基因可以显著提高N8耐药水平，但靶位酶基因突变与qnr基因捕获的先后有待进一步研究。

综上，本地区近2年志贺菌主要流行菌型为宋内氏志贺菌，对多种抗生素耐药率较高，且多重耐药菌株比例高。对氟喹诺酮类药物耐药率低，且耐药菌全部为福氏志贺菌。志贺菌氟喹诺酮药物耐药机制同时存在染色体介导的靶位酶突变及携带质粒介导的耐药基因，但以靶位酶突变为主。

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