凝胶渗透色谱净化-气相色谱法同时测定饲料中4种抗氧化剂

四川省农业科学院分析测试中心 杨晓凤

抗氧化剂是确保饲料卫生安全的有效途径之一，可作为饲料抗氧化剂的物质很多，如乙氧基喹（EQ）、叔丁基羟基茴香醚（BHA）、2，6-二叔丁基对甲酚（BHT）和叔丁基对苯二酚（TBHQ）等。1998年11月召开的全国饲料添加剂标委会上规定：配合饲料中使用抗氧化剂的最高浓度是150 mg/kg（指批准使用的各种抗氧化剂的浓度总和），超量添加抗氧化剂受到限制（李侯根，2000）。因此，有必要建立一种快速、准确、可靠的检测方法。

近年来，对抗氧化剂的检测方法主要有气相色谱法（穆同娜等，2007；李兴根和韩芷玲，2006）、液相色谱法（胡小钟等，2000）和气相色谱-质谱法（郭岚等，2007；岳振峰等，2004），但同时测定BHA、BHT、TBHQ和EQ 4种抗氧化剂的报道较少。本研究旨在建立用气相色谱法同时测定饲料中4种抗氧化剂的方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 美国Agilent 7890A气相色谱仪，配有自动进样器、FID检测器；美国J2 Scientific凝胶渗透色谱仪，配有Biobeads S-X3玻璃柱（型号：CO785，22 g，19 cm×2 cm）； 瑞士 Büchi旋转蒸发仪。

丙酮（色谱纯）、乙腈（色谱纯）、乙酸乙酯（分析纯）、环己烷（分析纯）。

标准品：BHA、BHT、TBHQ和EQ均购自德国Dr.Ehrenstorfer公司。

标准溶液配制：（1）BHA、BHT、TBHQ： 准确称取各标准品50 mg，分别置于50 mL容量瓶中，用丙酮溶解并定容至刻度，此储备液浓度为1.0 mg/mL。临用时，根据需要，用丙酮稀释成不同浓度的标准使用液。（2）EQ：准确称取250 mg，置于50 mL容量瓶中，用丙酮溶解并定容至刻度，此储备液浓度为5.0 mg/mL。临用时，根据需要，用丙酮稀释成不同浓度的标准使用液。

1.2 色谱分析条件 色谱柱为Rxi-17石英毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），载气为高纯氮气（纯度 ≥ 99.999%）；进样方式：分流进样（分流比=10∶1）；恒流模式：氮气流速为 2.0 mL/min；氢气流速：30 mL/min，空气流速：400 mL/min；进样口温度：230℃，检测器温度：300℃，柱温采用程序升温：始温100℃，以15℃/min升到240℃，保持2 min。在此条件下的标准色谱图（标样浓度为100 mg/L）及加标回收样品色谱图（添加水平为100 mg/kg）见图 1。

1.3 样品检测步骤

1.3.1 溶剂筛选及提取方法 选择乙睛、甲醇、正己烷、丙酮、二氯甲烷5种提取剂，比较提法，效果及回收率。提取方法为：称取2 g（精确至0.001 g）饲料于50 mL离心管中，加人15 mL提取剂，用高速均质器以10000 r/min提取2 min，再以4000 r/min离心3 min，倾出上清液于100 mL鸡心瓶中，重复提取一次，合并提取液，于45℃旋转蒸发至近干，用10.0 mL乙酸乙酯+环己烷（1+1）溶解残渣，过0.45 μm滤膜，供凝胶净化。

1.3.2 GPC净化 试验选择了500 mg/L的混合标样直接过凝胶渗透色谱柱（Biobeads S-X3），采用体积比为1:1的乙酸乙酯-环己烷作为流动相，进样量为5 mL，流速为4.7 mL/min，从8 min起每1 min收集一份样品，共收集8份样品溶液，分别用气相色谱检测各段流出液中BHA、BHT、TBHQ和EQ的含量。收集9～13 min流出的组分于旋蒸瓶中，45℃旋转蒸发至近干，用丙酮定容至5.0 mL，溶液过0.45 μm滤膜，供气相色谱测定。

1.3.3 4种抗氧化剂的线性关系与检出限 用气相色谱（GC）分析法检测四种抗氧剂在不同浓度下（10、20、50、100、200、300、400 mg/L）的浓度 C与峰面积A进行相关性分析，同时确定各氧化剂的检出限。

1.3.4 准确度与精密度评价,在鱼粉样品中分别添加一定量的混合抗氧化剂标准溶液，使添加浓度分别为50、100、200 mg/kg，按上述所选择的最优条件进行测定，每个浓度重复实验5次，得出4种抗氧化剂的回收率及相对标准偏差（RSD），

2 结果与讨论

2.1 提取溶剂的选择 5种提取溶剂提取结果如下：其中，二氯甲烷提取的杂质较多，颜色最深，且由于二氯甲烷的密度较大，样品离心时难以分层；甲醇提取的颜色次之，不利于净化；正己烷提取的回收率不能满足要求；而乙腈和丙酮的回收率都能满足要求，但丙酮提取液的颜色较乙腈提取液的颜色深，故也不被采用；乙腈极性大，穿透力强，且乙腈作为提取溶剂时很多亲脂性化合物如脂肪等较少地被萃取出来，更便于净化，因此，本实验采用乙腈作为提取剂。

2.2 凝胶渗透色谱净化结果 实验结果发现：第9分钟的流出液中开始检出BHT、BHA、TBHQ，第10分钟开始检出EQ，第11 min 4种抗氧化剂均被检出，第12分钟未检出BHT、BHA、TBHQ，只检出EQ，第13分钟也只检出微量 EQ；第14分钟未检出抗氧化剂。因此，选择留出时间为9～13 min作为4种抗氧化剂的收集时间（即收集第42～66 mL的流出液）。同时，对于饲料样品而言，油脂和绝大部分色素在9 min前被去除掉，说明本净化方法达到了将目标化合物和干扰杂质分离的效果。

2.3 方法的线性关系和检出限 表1是4种抗氧化剂在不同浓度（10、20、50、100、200、300、400 mg/L）水平下进行色谱分析得到的浓度（C）与峰面积（A）的线性回归方程及相关系数。从表1可以看出，在所测定的范围内，4种抗氧化剂峰面积与浓度呈良好的线性关系，能准确定量。

表1 4种抗氧化剂的保留时间、线性方程和检出限

2.4 方法的准确度与精密度 结果见表2。从表2可以看出，BHT、BHA、EQ在三种不同浓度时的回收率均大于95%（除BHA 50 mg/kg为94.7%以外），TBHQ均大于80%且4种抗氧化RSD值均小于5%。因此该法具有较好的准确性和精密度，适合饲料样品中抗氧化剂的测定。

表2 方法的回收率及精密度 %

3 结论

GPC-GC能够去除样品中脂肪和色素等大分子杂质，操作简单，重现性好，自动化程度高，能够满足大量样品的快速检测要求，可很好地用于饲料中抗氧化剂的测定。

[1]郭岚，谢明勇，鄢爱平，等.气相色谱-质谱法同时测定食用植物油中三种抗氧化剂[J].分析科学学报，2007，23（2）：169 ～172.

[2]胡小钟，余建新，钱浩明，等.油脂中九种抗氧化剂的反相高效液相色谱法分离和测定[J].分析科学学报，2000，16（1）：23 ～26.

[3]李兴根，韩芷玲.毛细管气相色谱法测定食品中的酚类抗氧化剂[J].粮油食品科技，2006，14（2）：55 ～56.

[4]李侯根.饲料抗氧化剂的现状和发展动态 [J].精细与专用化学品，2000，8：3 ～5.

[5]穆同娜，许华，李伟.凝胶渗透色谱-气相色谱法测定食用油脂中抗氧化剂 BHA、BHT[J].食品工业科技，2007，28（1）：228 ～230.

[6]岳振峰，蓝芳，谢丽琪.气相色谱-质谱法测定XO酱中BHA、BHT和TBHQ[J].中国粮油学报，2004，19（5）:83 ～85.