高效液相色谱法测定饲料中氯烯雌醚

农业部饲料质量监督检验测试中心（成都） 李 云 赵立军 张 静

氯烯雌醚为一种非甾体雌激素类药，能调节垂体前叶释放促性腺激素，通过减少下丘脑促黄体生成素释放因子的释放，降低促卵泡激素（FSH）、促黄体生成激素（LH）从垂体的释放。氯烯雌醚贮藏于脂肪组织内，并缓慢释放，较易在动物体内残留。若食用含有氯烯雌醚残留的肉食品后会扰乱人体激素平衡。由于氯烯雌醚能够通过蛋白质同化作用提高食欲、促进畜禽生长，有可能被添加到饲料中用来提高饲料转化率。

我国已明令禁止在饲料中添加氯烯雌醚，因此有必要制定其定量检测方法。目前药物中氯烯雌醚的测定方法有滴定法、高效液相色谱法等，但有关饲料中氯烯雌醚的测定方法鲜见报道。本文建立了饲料中氯烯雌醚的提取、净化和测定方法。该方法方便实用、准确可靠。

1 材料与仪器

1.1 试剂与材料 除非另有规定，仅使用分析纯试剂和符合GB/T6682的三级水，色谱分析用水符合GB/T6682一级水的规定。甲醇：色谱纯；乙腈：色谱纯；氨水：浓度25%～28%；C18固相萃取柱：200 mg/3 mL；滤膜：0.45 μm，有机相；流动相∶甲醇∶水=82∶18（V∶V）；氯烯雌醚标准品（纯度 ＞95%）。

氯烯雌醚标准溶液的配置：（1）标准储备液：称取10.0 mg（精确到0.1 mg）的氯烯雌醚标准品，用甲醇溶解并定容于100 mL容量瓶中，该溶液浓度为100 μg/mL，于4℃冰箱内贮存，有效期1个月。（2）标准工作液：用移液管分别准确移取标准储备液用甲醇配制标准工作溶液：0.05 μg/mL，1.0 μg/mL，2.0 μg/mL，5.0 μg/mL，10.0 μg/mL，20.0 μg/mL，50.0 μg/mL。现配现用。 淋洗液：25%氨水∶水=5∶95（V∶V）。

1.2 仪器与设备 高效液相色谱仪，配有二极管阵列检测器或紫外检测器；离心机：5000 r/min以上；涡旋混合器；超声波清洗器；氮吹仪，可控温至50℃；固相萃取装置；高速匀质器；振荡器；带盖塑料离心管：50 mL。

2 方法与结果

2.1 液相色谱条件 色谱柱：C18柱（4.6 mm×250 mm，粒度5 μm）或性能相当的色谱柱；柱温30 ℃；流动相流速：1.0 mL/min；检测波长：307 nm；进样量：20 μL。

2.2 试样的提取与净化

2.2.1 提取 准确称取配合饲料5 g、浓缩饲料或添加剂预混合饲料称取2 g（精确到0.01 g），置于50 mL离心管中，加入提取液乙腈10.0 mL，涡旋振荡2 min。然后将离心管置于振荡器上振荡20 min，然后在离心机上以5000 r/min离心5 min，吸取上清液于另一具塞试管中，待净化。

2.2.2 净化 每一试样各准备一只C18小柱，依次用3 mL甲醇、3 mL蒸馏水、3 mL甲醇活化。将上述提取液3.0 mL与等体积的蒸馏水混合均匀后，吸取5.0 mL过此小柱（流速＜1.0 mL/min）。用6 mL淋洗液淋洗,最后用3 mL甲醇洗脱，收集洗脱液于10 mL试管内，洗脱液于50℃下用氮气吹干，残余物用1.0 mL甲醇定容，涡旋混合1 min，过0.45 μm滤膜作为试样制备液，供高效液相色谱测定。

2.3 标准曲线的绘制 在选定的色谱条件下，将分别配制为 0.05、0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/mL的标准工作液，将不同浓度的标准工作液分别进样20 μL做定量校正曲线。以进样浓度x（μg/mL）为横坐标，以峰面积y为纵坐标，做标准曲线（结果见表1）。结果表明，氯烯雌醚标准工作液在0.05～50.0 μg/mL浓度范围内有良好的线性关系。

回归方程：y=50.596x－8.463（R=0.9996）。

表1 标准曲线绘制

2.4 检测限和检出限 在本试验条件下，将氯烯雌醚标准溶液连续稀释后加入到空白饲料中经提取测定，根据信噪比（S/N）=3的峰响应值和样品前处理的稀释倍数，得出方法的检测限为0.1 mg/kg。同样的添加适量标准溶液至空白饲料，经提取测定，依据信噪比（S/N）=10测得方法的定量限为0.3 mg/kg。

2.5 回收率实验及精密度 为了考查方法及仪器的准确度，对猪饲料﹑禽饲料﹑鱼饲料样品进行了回收率实验，每个水平平行测定5次，回收率多数大于80.0%；相对偏差小于5.0%，变异系数小于7.0%。结果见表2﹑表3和表4。从表中可以看出，本方法在三种空白饲料中的平均回收率范围为76.6%～107.0%，符合分析的要求。变异系数范围在10%以下，表明方法符合痕量分析的精密度要求。

表2 猪饲料回收率实验及精密度

表3 禽饲料回收率实验及精密度

表4 鱼饲料回收率实验及精密度

3 讨论

3.1 提取条件的选择 氯烯雌醚可以用甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯等有机溶剂提取，结果表明，甲醇、乙腈、丙酮三种溶剂提取效率相当,乙酸乙酯提取效率较低。但乙腈比甲醇、丙酮所提取得到的干扰杂质要少，因此选用乙腈作为提取溶剂。

对乙腈的用量也进行了比较，当选用20 mL时，虽然对高添加浓度的回收率较好，但此时配合饲料添加较低浓度（0.5 mg/kg）仪器响应不明显，经过优化将提取溶剂选择在10 mL，减少对待测物质的稀释。此外，当预混合饲料中添加氯烯雌醚的量超过200.0 mg/kg时，固相萃取柱吸附可能过载，致使回收率开始下降，因此需将提取液稀释后再进行净化。

3.2 净化条件的选择 本方法采用C18固相萃取柱。通过向提取液中加入等倍的水来调节提取液的溶液强度，进而使待测物质有效地吸附在固相萃取柱上，用氨水淋洗水溶性杂质，从而达到分离净化的目的。经实验优化用5%的氨水溶液能更好的除去杂质，其结果并不影响回收率。本实验还做了甲醇、乙腈和丙酮三种溶剂的洗脱效果进行了比较，这三种溶剂均能定量洗脱被测物，因为色谱流动相采用甲醇，所以本方法采用甲醇为洗脱剂，得到的色谱峰对称性更好。甲醇的用量对回收率有影响，用量太少，洗脱不完全，用量太多，洗脱时间长，本方法选用3 mL甲醇为洗脱试剂，效果最好，标准品过柱率可达96.2%。

3.3 色谱检测波长的选择 已报道的氯烯雌醚测定方法中波长均为247 nm。本实验用紫外分光光度计对氯烯雌醚的紫外吸收光谱进行了测定。在200～400 nm之间，氯烯雌醚的紫外最大吸收波长分别位于247 nm处与307 nm处，如下图1所示。

图1 氯烯雌醚紫外吸收光谱图

当实验选择247 nm为分析波长时，虽然此时氯烯雌醚有最大的紫外吸收，检测灵敏度很高，但是由于饲料基质复杂，多数杂质在247 nm附近也存在强烈的紫外吸收，进而对氯烯雌醚的测定造成严重的干扰，较低含量的氯烯雌醚在测定时被杂质所掩盖，分离度大大降低，极大地影响了实验测定的检测限。当实验选择307 nm为分析波长时，尽管氯烯雌醚在此时的紫外吸收不是最强，但此时饲料中多数杂质在此处没有紫外吸收且饲料中常见药物添加剂未见干扰。因此，本实验选择307 nm作为测定波长。

4 结论

本实验建立的饲料中氯烯雌醚的测定方法具有较高的灵敏度、准确度和精密度，且回收率较高。样品的提取和净化方法操作简单，易于掌握，适用于饲料中违禁药物氯烯雌醚的检测。