抗骨增生片对兔膝骨关节炎软骨组织病理形态及 MMP-1、TIMP-1的影响*

河北省秦皇岛市第二医院 尹学永 王志文 赵 鑫 （秦皇岛 066600）

抗骨增生片具有补肾强骨、活血通络、消肿止痛之效,临床应用治疗骨关节炎取得满意疗效。该研究通过建立兔膝骨关节炎模型,观察抗骨增生片对关节软骨组织病理形态及MMP-1、TIMP-1表达的影响,以进一步探讨其作用机理。

1 材料与方法

1.1 药物 抗骨增生片: 〔熟地黄、鹿衔草、骨碎补（烫）、淫羊藿、肉苁蓉、鸡血藤、莱菔子 （炒）〕,通化华夏药业有限责任公司生产,批准文号:国药准字Z22023683。

1.2 实验动物 健康雄性日本大耳白兔 30只,体重 2.5 kg±150 g。于室温分笼饲养,按顿供给标准饲料,自由活动、饮水。

1.3 仪器及试剂 木瓜蛋白酶购自天津市诺奥科技发展有限公司,活力 200万U/g;MMP-1免疫组化试剂盒由上海麦莎生物科技有限公司提供;TIMP-1免疫组化试剂盒由武汉博士德生物科技有限公司提供;石蜡组织切片机,天津天利航空机电有限公司;光学显微镜,BX 50型,日本OLYMPUS公司生产。

1.4 方法

1.4.1 动物分组:健康雄性日本大耳白兔 30只,适应性喂养 1周后,将动物按体重由小到大编号,查随机数字表将大耳白兔分为 3组:A（正常对照组）、B（模型对照组）、C（抗骨增生片给药组）,每组 10只。

1.4.2 模型建立:参照日本鬼头康彦[1]等的兔膝关节腔内注入木瓜蛋白酶造成骨关节炎病变模型方法,用氯氨酮注射液肌肉注射 （10mg/kg）将兔麻醉后,于膝关节处剔毛,碘伏消毒,将关节轻弯,经髌腱两侧进针,右膝关节腔内注射 1.6%木瓜蛋白酶生理盐水溶液 0.5 mL,隔 3天注射 1次,共注射 3次。

1.4.3 给药:于造模完成后第 2天开始给药。C组按成人kg/d体重用药量的 6倍剂量作为大耳白兔kg/d体重的等效剂量 （抗骨增生片 0.36 g/kg）,溶于 10m L生理盐水中灌胃,每日1次;A、B组灌入等量生理盐水;共灌胃 4周。

1.4.4 标本采集及处理:于末次给药后 24 h气栓法处死动物,逐层切开膝关节,肉眼观察关节、滑膜及关节软骨病理改变,切取胫骨内侧髁软骨,10%中性福尔马林溶液固定后,石蜡包埋,切片,作HE染色及免疫组织化学观察。

1.4.5 数据处理:病理组织学评分采用非参数秩和检验,免疫组化结果采用方差分析,运用 SPSS13.10统计学软件进行分析。

2 结果

2.1 大体观察 A组兔膝关节无肿胀、充血,关节液透明,关节软骨呈淡蓝色、半透明、光滑,滑膜无水肿、肥厚;B组兔右膝关节明显肿胀、充血,关节液呈浅黄色稍混浊,关节软骨无光泽、不光滑、不透明,有缺损,可见明显溃疡面及裂隙,少数可见软骨下骨裸露,以胫骨内侧髁明显,滑膜明显充血、水肿、肥厚;C组兔右膝关节轻度肿胀,无明显充血,关节液透明稍浅黄,关节软骨欠光泽、透明度减低,有轻度缺损,未见到明显溃疡面和软骨下骨裸露,滑膜充血、水肿程度较B组明显减轻。

2.2 光镜观察 HE染色切片镜下观察,参考彭氏[2]法进行组织病理学分级:按镜下所见分为 4级:Ⅰ级:软骨面平整,厚度正常,细胞数及排列正常;Ⅱ级:软骨面不平整,细胞数减少,细胞排列不规则,可见有新生血管;Ⅲ级:软骨面可见裂隙及浅表溃疡病变,细胞排列紊乱,细胞数不多,可见少量炎细胞浸润;Ⅳ级:软骨表面可见明显溃疡病变,达软骨深层,细胞数明显减少,排列紊乱,有明显炎细胞浸润,骨质暴露。结果见表1。

2.3 免疫组织化学法观察 MMP-1、TIMP-1表达 结果判定标准:每张切片随机取 6个视野 （400倍）,其中 3个位于软骨表层和中上层,另 3个位于软骨中下层和下层,计算每个视野的阳性细胞数和细胞总数,MMP-1、TIMP-1的表达量用细胞分数,即阳性细胞数占细胞总数的百分比表示,最大值为 100%,每张切片的细胞计数分别由两个独立的观察者进行,评分误差率控制在5%以内,取二者均值为最后的得分。结果见表 2。

表1 抗骨增生片对关节软骨病理形态的影响

表2 抗骨增生片对关节软骨 MMP-1、TIMP-1表达的影响

3 讨论

骨关节炎 （OA）又称增生性关节炎、退行性关节炎,好发于膝、髋、腰椎等负重大关节。膝骨关节炎 （KOA）是中老年人常见、多发的骨关节病,发病与衰老、创伤、炎症、肥胖、代谢障碍和免疫、遗传等因素有关,其确切发病机制尚未明确,但关节软骨的退行性改变为 OA发病的核心环节已得到共识,蛋白酶异常分泌造成软骨细胞外基质 （ECM）过量降解在这一过程中起着重要作用。

近年研究提示基质金属蛋白酶 （MMPs）在OA发病中起主要的作用,[3-4]有研究认为 MMPs对关节软骨细胞外基质的损伤是 OA发病的 “共同通路”,MMPs的异常增高及与其抑制剂 （TIMP）之间动态平衡的失调,已成为骨关节炎发病机制研究的热点。MMP-1属于胶原酶亚族,可切割Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅷ、Ⅹ型胶原及明胶、可聚蛋白多糖等,在软骨基质中最具特征、含量最多的Ⅱ型胶原的降解中起着关键的作用,[5]由于Ⅱ型胶原结构的破坏及蛋白多糖的过度降解,使软骨失去正常的弹性及变形能力,关节软骨功能恶化。正常情况下,MMP-1与其抑制剂 TIMP-1以 1︰ 1的比例特异性结合以维持细胞外基质合成与降解的平衡。研究发现,骨关节炎患者软骨细胞有高表达的 MMP-1,而TIMP-1增加甚少,呈现 MMPs/TIMPs的失衡,从而导致软骨降解增加。Marini等[6]证实了关节软骨的降解是由于MMP和 TIMP之间的失衡造成的,且 MMP/TIMP之比与内窥镜检查的疾病进程呈相关性。

骨关节炎属中医学 “骨痹”、“痛痹”范畴,其发病与肝肾亏虚、瘀血凝滞密切相关。 《素问◦调逆论篇》提出“是人者,素肾气胜,以水为事;太阳气衰,肾脂枯不长;一水不能胜两火,肾者水也,而生于骨,肾不生,则髓不能满,故寒甚至骨也……病名曰骨痹,是人当挛急也。”清楚的表明了肾气衰弱是骨痹发生的病机关键。唐容川 《血证论》提出 “痹由瘀血致病”说,认为瘀血是痹证发病的重要因素。抗骨增生片适用于肥大性脊椎炎、颈椎病、跟骨刺、增生性关节炎、大骨节病。方中熟地黄、骨碎补、淫羊藿、肉苁蓉具补肾益精、填髓壮骨之效,鸡血藤、鹿衔草、莱菔子具理气活血、祛风除湿之功,组方切合骨痹肾虚、血瘀之病机,临床应用能有效缓解膝骨关节炎疼痛、晨僵,消除关节肿胀,恢复关节功能,延缓病情的进展。相关研究[7]表明补肾中药与活血中药均能保护软骨细胞及维持软骨的完整性,延缓软骨内胶原的破坏及性质改变,抑制滑膜炎症及增生,对防止骨关节炎的形成与发展起着非常重要的作用。王氏[8]等报道抗骨增生片能具有明显的降低全血黏度 （低切速）、血浆黏度、全血还原黏度,并显著减少血浆中纤维蛋白原含量的作用,具有良好的活血化瘀作用,从而改善局部血液循环,有利于由骨刺引起的水肿消退、炎症吸收。骨碎补含橙皮甙、骨碎补双氢黄酮甙、骨碎补酸等,能促进骨对钙的吸收,并提高血钙和血磷水平,有利于骨折的愈合,有一定的改善软骨细胞功能,推迟细胞退行性变的作用;鸡血藤、莱菔子、骨碎补还具有一定的抗炎镇痛作用。[9]

研究结果表明,抗骨增生片有效减轻了膝关节滑膜炎性改变,能降低软骨病理损害程度,延缓膝骨关节炎软骨的退行性改变,其抑制软骨基质降解、促进软骨修复作用可能与调节关节软骨 MMP-1及 TIMP-1的异常表达有关。抗骨增生片治疗KOA可能是多靶点、多途径,该药通过对软骨基质的作用之外,是否可通过影响软骨细胞凋亡等途径而起到治疗作用,仍需进一步进行研究。

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（2011-02-22 收稿）