毒素胁迫对紫茎泽兰挥发物的影响

张红玉，杨 斌，何月秋

(1.贵州师范大学生命科学学院,贵州 贵阳 550001; 2.西南林业大学 云南省高校森林灾害预警与控制重点实验室,云南 昆明650224; 3.云南农业大学植物病理重点实验室,云南 昆明650201)

植物为了有效地保护自身免受病虫害的侵害而经长期进化产生了一系列化学防御物质。其中，当植物遭受病原菌侵染、昆虫取食、化学因子、机械损伤时均能造成某些挥发性组分(volatile organic compounds,VOCs)的大量释放[1-3]。在各类挥发性组分当中，不少组分具有抑菌抑虫活性，可能充当了直接阻止、抵御病原菌侵染或昆虫取食的化学防卫因素；有的组分是植物防卫基因表达的高效调节子；还有的组分是植物自身或植物间传递信息的化学信号分子，例如植物报警信号(warning signal)、引诱捕食性或寄生性天敌信号(guiding signal)[4]。作为植物次生代谢产物，这些挥发物在提高植物自身保护和生存竞争能力、协调与环境的关系中充当着重要的角色[5]，对植物的化学防御起到重要的作用并具有重要的生态学意义[6-7]。

随着研究的深入，人们对挥发物产生、释放及其在植物化学防御中的作用机制已有越来越多的认识，尤其对于虫害诱导产生的植物挥发性化合物(herbivore-induced plant volatiles，HIPVs)的代谢调控机制已进行了大量研究[8]，但对于病原菌毒素胁迫下植物挥发性组分的研究还比较少。紫茎泽兰(Eupatoriumadenophorum)挥发性化合物本身具有抑菌活性[9]，但松针褐斑病菌(Lecanostictaacicola)毒素胁迫对于紫茎泽兰挥发性组分及其化学防御有何影响尚不清楚。本研究测定该毒素胁迫对紫茎泽兰挥发性组分的影响，探讨毒素胁迫对紫茎泽兰化学防御可能存在的影响，以期为进一步阐明松针褐斑病菌毒素对紫茎泽兰的伤害机理和恶草抗性问题奠定基础。

1 材料与方法

1.1试验材料

供试杂草：紫茎泽兰采自西南林业大学校园内。

供试病原真菌：松针褐斑病菌由福建沙县官庄林场严重感病的湿地松(Pinuselliottii)松针上分离得到。经分离、纯化，菌种保存于西南林业大学微生物实验室。

试验仪器：气相色谱-质谱联用仪(GS-MS，FINNIGAN TOP 8000/VOYAGER)、水蒸气蒸馏提取器。

1.2试验方法

1.2.1供试松针褐斑病菌毒素粗提溶液的制备 参照杨斌等[10]的方法，具体步骤如下：

1)病原真菌产毒培养：挑取经PDA扩繁10 d后的菌丝，接种于已灭菌并装有 250 mL PD培养液的三角瓶中(每个三角瓶接种菌丝块大小基本一致)，置于摇床上，转速120 r/min，25 ℃下振荡培养25 d。用垫有双层滤纸的布氏漏斗真空抽滤培养物，滤去菌丝即得毒素原液。

2)毒素粗提溶液制备：取毒素原液100 mL，置于真空旋转蒸发仪内，60 ℃下抽真空旋转将水分蒸干。然后，分3次共加入300 mL氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿∶甲醇=2∶3)，40 ℃下振荡提取30 min,重复3次以便提取充分。合并3次提取液，在40 ℃下经真空旋转蒸去有机溶剂，蒸干后得毒素粗提物，置于4 ℃冰箱中保存备用。用无菌水将毒素粗提物配制成2.5 mg/mL的溶液，作为供试毒素粗提液。

1.2.2供试杂草材料的初处理 自无病虫害的紫茎泽兰植株摘取生长均匀一致的叶片，先用自来水冲洗，再用滤纸吸干水分，混合均匀，待用。从以上叶片中，称取130 g紫茎泽兰新鲜叶片(样品A)；再称取130 g，置于2.5 mg/mL毒素粗提液中，浸泡48 h后，滤去毒素粗提液，叶片用蒸馏水冲洗干净，为毒素胁迫紫茎泽兰离体叶片(样品B)。取一定量的紫茎泽兰植株，插于2.5 mg/mL毒素粗提液中，48 h后，采下叶片，称取130 g，为毒素胁迫紫茎泽兰植株的离体叶片(样品C)。

1.2.3挥发油的提取 采用蒸馏萃取法分别对3种不同处理的叶片材料进行挥发油的提取，萃取溶剂为石油醚。把材料放入蒸馏萃取装置一端的500 mL圆底烧瓶中，用电热套加热；装置的另一端为盛有25 mL石油醚的100 mL圆底烧瓶，在60 ℃下水浴加热[11]。同时蒸馏萃取4 h，再蒸去石油醚，得到具有浓烈香味的浅黄色挥发油，样品A、B和C的收油率分别为0.20%、0.89%和0.19%。

1.2.4挥发油的气相色谱-质谱联谱分析 GC-MS分析测试条件为，色谱柱HP-5MS(60 m×0.32 mm×0.25 μm)；载气He；流速1 mL/min；进样温度240 ℃；接口温度250 ℃；质谱扫描范围为35～455 amu；离子源EI源；电子能量70 eV。

2 结果与分析

3种不同处理方法得到的挥发性成分的气相色谱-质谱联谱分析总离子流图分别见图1(186个峰)、图2(259个峰)、图3(232个峰)。以相似度>80，相对含量>0.1%为数据处理标准，排除一些可信度不高、含量极少的物质。

2.1不同样品所产生挥发物的组分差异 经数据处理，样品A、B、C产生的挥发物组分数分别为39、60、53个，样品B为样品A组分数的近1.54倍，样品C为样品A组分数的近1.36倍，说明松针褐斑病菌毒素胁迫可诱导紫茎泽兰离体叶片产生更多的挥发物组分。其中，受毒素胁迫紫茎泽兰离体叶片较受毒素胁迫紫茎泽兰植株的离体叶片产生的挥发物组分数更多。

样品A、B、C产生的挥发物当中，相对含量大于2%的主要组分各有6个、11个、9个。以样品B所产生挥发物的主要组分最多，其次为样品C，样品A相对最少。结果表明，与新鲜离体叶片相比，受毒素胁迫后，紫茎泽兰离体叶片不仅产生了更多种挥发物组分，而且相对含量超过2%的主要组分的个数也增至新鲜叶片的1.83倍和1.50倍。

不同样品所产生的挥发物主要组分及其含量明显不同(表1)，仅α-红没药醇(α-Bisabolol)是不同样品中唯一共有的主要组分，但在不同样品中的含量有差异。α-红没药醇在样品A、B、C所产生挥发物当中的相对含量分别为7.19%、4.60%、5.08%，表明新鲜叶片中的α-红没药醇明显高于该挥发物在受毒素胁迫离体叶片和受毒素胁迫植株的离体叶片当中的相对含量，由此显示出受毒素胁迫后，紫茎泽兰离体叶片所产生的α-红没药醇相对含量较新鲜叶片有不同程度的减少。另外，在样品A和样品B中，α-红没药醇是相对含量最高的组分；在样品C中，它的相对含量仅略次于乙酸冰片酯。前人研究[12]表明，α-红没药醇具有广谱抗菌作用，也是鸡血藤(Caulisspatholobi)等多种植物的挥发物当中相对含量较高的组分。乙酸冰片酯是样品B和样品C共有的挥发物主要组分，且相对含量均超过4%，但该组分不存在于样品A当中，是受毒素胁迫后才产生的主要组分。

受胁迫离体叶片和受胁迫植株离体叶片产生的挥发物的组分及其相对含量存在差异，这可能与受毒素胁迫的部位不同有关，进一步的可能性原因是：紫茎泽兰不同部位在受到毒素胁迫后产生挥发物的时间、途径各不相同，最终造成挥发物的组分及其相对含量因受胁迫部位不同而出现差异。

以往的研究[13-14]表明，不同真菌毒素的除草活性、作用位点、作用机制、致病机理各不相同，结合本研究结果，可以推断：毒素胁迫杂草的方式不同或者部位不同，直接影响到杂草合成组分各异、相对含量不同的挥发物。因此，如果进一步研究毒素胁迫对杂草化学防御的作用机制或调控机制，很可能有助于为人们寻求新的杂草除控策略提供新思路。

图1 新鲜叶片内挥发物GC-MS分析总离子流

图2 毒素胁迫离体叶片内挥发油GC-MS分析总离子流

图3 毒素胁迫植株叶片内挥发油GC-MS分析总离子流

2.2不同样品所产生脂肪类、芳香类和萜类挥发物的差异 经GC-MS测试分析，紫茎泽兰挥发性化合物的基本化学组成为脂肪族化合物、萜类化合物和芳香族化合物(表2)。这几类植物挥发性物质大多具有抑菌、杀菌或杀虫活性[15-20]，或者可以作为植物抵御病原菌侵染的防卫因子及信号分子[7]。

与样品A相比，受毒素胁迫后，不论是样品B，还是样品C，脂肪族类和萜类组分数均增加，萜类组分的增加尤其明显，与此相反，芳香族类组分减少(表2)。

芳香族化合物(含有苯环)属于碳环化合物(含有完全由碳原子组成的环)；萜类化合物是具有(C5H8)n通式以及其含氧和不同饱和程度的衍生物，可以看成是由异戊二烯或异戊烷以各种方式连结而成的一类天然化合物；脂肪族化合物，又称为直链化合物，其结构特点是碳与碳间连接成不闭口的链。从某种意义上说，毒素胁迫后挥发性化合物双键比例减少，是还原反应的结果，挥发性成分大量被还原，显示有另外的物质发生了氧化反应。

表1 不同样品中挥发物的主要组分及其相对含量

表2 不同样品中各类挥发物的数量差异

3 讨论

前人研究[21-22]表明，由松针褐斑病菌产生的毒素不仅是寄主松科植物的致病毒素，而且属于非寄主专化性毒素，能使空心莲子草(Alternantheraphiloxeroides)、稗草(Echinochloacrusgalli)表现出明显的伤害症状，生长受到抑制。此外，该毒素对外来入侵杂草紫茎泽兰的胁迫研究表明，毒素胁迫能引起紫茎泽兰过氧化氢酶(catalase)、抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase)等6种抗病相关酶活性发生变化[23]，能诱发紫茎泽兰叶片电解质渗漏[24]，诱发钙和钾等矿质元素渗漏[25]，从而影响紫茎泽兰对病虫害的化学防御能力。

已有文献报道[26-28]，紫茎泽兰具有化感作用，本研究通过对松针褐斑病菌毒素胁迫下紫茎泽兰叶片气相色谱-质谱联用仪的分析证实了这一点。同时发现，毒素作用后紫茎泽兰挥发物的成分明显增多，其中脂肪族类和萜类化合物数量增多，而芳香族化合物数量减少，这不仅说明松针褐斑病菌毒素胁迫可诱导紫茎泽兰产生更多的具有抗病虫活性的挥发性化合物，而且还预示着遭受毒素胁迫后，紫茎泽兰叶片内出现了剧烈的生理生化反应。过去，从酶的角度证实过毒素胁迫能引起植物发生异常的生理生化反应，本研究从小分子代谢产物角度也证实这种异常反应的存在，化合物差异的巨大还说明，毒素影响的可能不止是某个反应链，而是整个反应系统。

从某种意义上说，松针褐斑病菌毒素胁迫后紫茎泽兰挥发物双键比例减少，这也从终产物的角度阐明该毒素诱发紫茎泽兰氧化反应，与过去认为毒素作用后植物活性氧含量增加的结论一致。病原菌侵入植物后可诱导活性氧的爆发，并且，活性氧在病原菌与植物的非寄主互作中较之在寄主互作中的积累更明显，活性氧的爆发已被认为是寄主防卫反应之一[26]。某些活性氧可以充当信号分子，在植物遭受病原菌的初始侵染后传递信号，从而使植物组织产生一系列的抗病防御反应[27-28]。当然，植物体内包括酶在内的很多物质对活性氧迸发都有重要影响[29]，即便不同的温度条件对活性氧代谢的影响也有所差异[30]。尽管毒素胁迫后紫茎泽兰体内活性氧代谢变化的真实情况尚待测定，而且活性氧迸发可能是多种活性氧总体的反应结果，但本研究至少从另一个侧面说明松针褐斑病菌毒素胁迫不仅关系到对紫茎泽兰抗性的影响，而且还关系到在紫茎泽兰与病虫害互作过程中起作用的其他因子或环节。

作为植物重要的化学防御途径，挥发性次生代谢产物在保护植物免遭病原菌、昆虫的侵染中发挥了重要作用。植物挥发性化合物的组成和含量受到植物不同基因型和化学型、不同发育时期，以及不同环境因子的影响[31-32]，这些差异与植物化学防御的关联值得进一步研究。另外，植物挥发性物质是多种复杂组分的混合物，植物抵御病原菌和植食性昆虫的策略亦是多组分协同作用的结果。因此，开展外来入侵杂草挥发性化合物的合成途径、调控机制、影响因素等方面的研究，进一步阐明挥发物在杂草化学防御反应中的作用，对研究和寻找除控杂草的有效途径具有指导意义。

[1]De Moraes C M,Lewis W J P,Paré W,etal.Herbivore-infested plants selectively attract parasitoids[J].Nature,1998,393:570-573.

[2]Hamilton-Kemp T R,McCracken C T,Loughrin J H,etal.Effects of some natural volatile compounds on the pathogenic fungiAlternariaalternataandBotrytiscinerea[J].Journal of Chemical Ecology,1992,18(7):1083-1086.

[3]Obara N,Hasegawa M,Kodama O.Induced volatiles in elicitor-treated and rice blast fungus-inoculated rice leaves[J].Bioscience，Biotechnology，and Biochemistry, 2002,66(12):2549-2559.

[4]Farmer E E. Surface-to-air signals[J].Nature,2001,411:854-856.

[5]Faini F,Labbe C,Salgado I,etal.Chemistry,toxicity and antifeedant activity of the resin ofFlourensiathurifera[J].Biochemical Systematics and Ecology,1997,25(3):189-193.

[6]高微微,佟建明,郭顺星.植物次生代谢产物的生态学功能研究进展[J].中国药学杂志,2006,41(13):961-964.

[7]何培青,柳春燕,郝林华,等.植物挥发性物质与植物抗病防御反应[J].植物生理学通讯,2005,41(1):105-110.

[8]穆丹,付建玉,刘守安,等.虫害诱导的植物挥发物代谢调控机制研究进展[J].生态学报,2010,30(15):4221-4233.

[9]田宇,侯婧,吴建平,等.紫茎泽兰挥发性成分及抑菌活性研究[J].农药学学报,2007,9(2):137-142.

[10]杨斌,刘吉开,叶建仁,等.松针褐斑病菌毒素LA-Ⅱ的分离纯化及化学结构[J].南京林业大学学报(自然科学版),2001,25(3):21-25.

[11]吴田捷,杨光忠.紫茎泽兰精油化学成分的GC/MS研究[J].华中师范大学学报(自然科学版),1994，28(1):87-90.

[12]高玉琼,刘建华,赵德刚.不同产地鸡血藤挥发性成分研究[J].中成药杂志,2006,28(4):555-557.

[13]张红玉.植物病原真菌毒素除草活性研究现状[J].草业科学,2009,26(10):160-164.

[14]徐娇,许文超,康占海,等.瓜果腐霉毒素对多年生黑麦草的致病作用机理初步研究[J].草业学报,2009,18(4):181-186.

[15]李明,曾任森,骆世明.次生代谢产物在植物抵抗病虫为害中的作用[J].中国生物防治,2007,23(3):269-273.

[16]彭少麟,南蓬.高等植物中的萜类化合物及其在生态系统中的作用[J].生态学杂志,2002,21(3):33-38.

[17]Boonchird C,Flegel T W.In vitro antifungal activity of eugenol and vanillin againstCandidaalbicansandCryptococcusneoformans[J].Canadian Journal of Microbiology,1982,28:1235-1241.

[18]Mahmoud A L E.Antifungal action and antiaflatoxigenic properties of some essential oil constituents[J].Letter in Applied Microbiology,1994,19:110-113.

[19]Celimene C C,Micales J A,Ferge L,etal.Efficacy of pinosylvins against white-rot and brown-rot fungi[J].Holzforschung,1999,53:491-497.

[20]Knobloch K,Pauli A,Iberl B,etal.Antibacterial and antifungal properties of essential oil components[J].Journal of Essential Oil Research,1989,1:119-128.

[21]叶建仁,解春霞.松针褐斑病菌致病机制的研究[J].林业科学研究,1998,11(3):243-248.

[22]叶建仁,祁高富.松针褐斑病菌毒素的专化性研究[J].南京林业大学学报,1999,23(6):1-4.

[23]杨斌,余静,陈勃.松针褐斑病菌毒素对紫茎泽兰抗病相关酶的影响[J].草业科学,2005,22(6):81-84.

[24]杨斌,余静,陈勃.松针褐斑病菌毒素诱发紫茎泽兰电解质渗漏对几种真菌的影响[J].草原与草坪,2005(3):52-55.

[25]张红玉,何月秋.松针褐斑病菌毒素诱发紫茎泽兰矿质元素渗漏的研究[J].草业科学,2009,26(4):83-86.

[26]宋启示,付昀,唐建维,等.紫茎泽兰的化学互感潜力[J].植物生态学报,2000,24(3):362-365.

[27]于兴军,于丹,马克平.不同生境条件下紫茎泽兰化感作用的变化与入侵力关系的研究[J].植物生态学报,2004,28(6):773-780.

[28]张学文,刘万学,万方浩,等.紫茎泽兰不同部位化感作用研究[J].河北农业大学学报,2007,36(7):59-63.

[29]李征,刘登义,王育鹏,等.活性氧在植物-病原物相互作用过程中的作用[J].安徽师范大学学报,2006,29(1):70-73.

[30]杜秀敏,殷文璇,赵彦修,等.植物中活性氧的产生及清除机制[J].植物工程学报,2001,17(2):121-125.

[31]吴顺,萧浪涛.植物体内活性氧代谢及其信号传导[J].湖南农业大学学报,2003,29(5):450-456.

[32]刘曼西.病原激发子对番茄阴离子过氧化物酶表达与反应氧迸发的诱导[J].植物生理学报,1996,23(2):220-226.

[33]董金皋,刘秀峰,李正平.HT-毒素胁迫下玉米叶片细胞的活性氧代谢及可能性作用[J].河北农业大学学报,2000,23(4):62-66.

[34]Collins J E,Lepp N W,Svoboda K P,etal.Changes in the volatile oil fromMonardacitriodoravar.citriodoradue to ontogeny[J].Chromatography and Analysis,1994,34:5-7.

[35]Galambosi B,Svoboda K P,Hampson J B,etal.Agronomicaland phytochemical investigation ofPycnanthemumspp. in Finland[J].Agricultural Science in Finland,1999,2:293-301.