低密度脂蛋白受体基因 I334V突变与高胆固醇血症的相关性

张明明,帖彦青,霍丽静,宋光耀

高胆固醇血症是冠心病及其他动脉粥样硬化性疾病的重要致病因素[1]。目前认为脂蛋白代谢相关酶或受体基因发生突变是引起胆固醇升高的主要原因,但具体机制目前尚未完全阐明。因此,了解患者胆固醇代谢相关的基因突变对于动脉粥样硬化性心脑血管疾病的早期防治具有重要意义。有研究发现低密度脂蛋白受体 (LDL-R)缺陷是引起高胆固醇血症的主要原因[2]。故本研究采用 PCR-RFLP方法对 LDL-R基因第 8外显子的 I334V突变的基因频率和基因型频率进行了检测,对I334V突变与血浆胆固醇水平的关系进行了探讨,试图为高胆固醇血症及动脉粥样硬化的防治提供遗传学的实验依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取 2008年12月—2009年 12月在我院体检中心进行体检的汉族人 1 390例,按照胆固醇水平分为 3组:(1)高胆固醇血症组 620例,总胆固醇 (TC)≥6.22 mmol/L(240 mg/dl)和三酰甘油 (TG)＜1.7 mmol/L;其中男 350例,女 270例;平均年龄 (48.1±10.2)岁。 (2)边缘高胆固醇血症组 420例,5.18 mmol/L＜TC＜6.19 mmol/L(200 mg/dl＜TC＜239mg/d l)和 TG＜1.7 mmol/L;其中男 240例,女 180例;平均年龄 (48.6±9.6)岁。(3)正常对照组 350例,TC≤5.18 mmol/L(200 mg/dl),TG＜1.7 mmol/L,且低密度脂蛋白胆固醇 (LDL-C) ＜3.12 mmol/L;其中男 200例,女 150例;平均年龄 (48.3±9.5)岁。3组受检者的性别、年龄间具有均衡性。血脂异常的诊断按照 《中国成人血脂异常防治指南》(2007)[3]的标准。3组受检者均除外甲状腺功能亢进症、甲状腺功能减退、慢性肝病、糖尿病、糖尿病肾病、肾病综合征、肾移植术后等影响脂类代谢的疾病,排除应用影响糖脂代谢药物者。

1.2 方法

1.2.1 检测指标 (1)一般指标:测量身高、体质量、腰围和血压,计算体质指数 (BMI):BMI=体质量 (kg)/身高2(m2)。(2)血脂测定:健康体检人群过夜空腹 12 h,次日清晨抽取肘静脉血 4ml置于促凝管中分离血清,待测血脂;另取 4 ml置于 EDTA抗凝管中,-80℃低温冰箱中保存,用于提取 DNA。TC、TG、高密度脂蛋白胆固醇 (HDL-C)采用酶法测定,采用 Beckman全自动生化分析仪检测,LDL-C按 Friedwald公式计算:LDL-C=TC-(HDL-C+TG/2.2)。

1.2.2 LDL-R基因的多态性分析 (1)人基因组 DNA的提取:EDTA抗凝血 400μl按照天根 TIANamp Blood DNA Kit血液基因组 DNA提取试剂盒 (离心柱型)说明书提取基因组DNA。(2)PCR扩增 LDL-R基因目的片段:引物设计采用生物学软件 Primer5.0,并与 Genebank进行比对。序列为:上游引物 5'-CCAAGCCTCTTTCTCTCTCTTCCAG-3',下游引物为 5'-CCACCCGCCGCCTTCCCGTGCTCAC-3';PCR反应体系:共 20μl,包括:Gotaq Green Master Mix 10μl、上下游引物 2 μl、基因组 DNA 2μl、无核酶水 6μl。 PCR反应采用降落聚合酶链反应技术,具体条件见参考文献[4]。(3)PCR反应产物的限制性片段长度多态性分析:PCR产物用限制性内切酶ClaⅠ进行酶切,反应体系共 20μl,包括 PCR扩增产物 5μl,限制性内切酶 1μl,Buffer 2μl以及双蒸水。于37℃水浴酶切4 h,加入 loading buffer 2μl终止反应。酶切产物经 8%聚丙烯酰胺凝胶 (PAGE-Gel)电泳,100 mV,50m in,并与 Marker比较,用 UVPGDS-8000凝胶图像分析系统鉴定,照相。

1.3 统计学方法 采用 SPSS 13.0软件进行统计检验。计量资料以 (±s)表示,多组间比较采用方差分析,基因频率采用基因计数法计算;组间基因型与等位基因频率比较采用χ2检验,危险因素分析采用单因素及多因素 Logistic回归分析,以 P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组受检者 BMI及血脂水平比较 高胆固醇血症组、边缘高胆固醇血症组的 BMI高于正常对照组,差异有统计学意义 (P＜0.05)。HDL-C水平在正常对照组、边缘高胆固醇血症组、高胆固醇血症组依次降低,TC、LDL-C水平则依次升高,组间两两比较差异均有统计学意义 (P＜0.05,见表1)。

2.2 LDL-R基因外显子 8的 I334V突变的 PCR-RFLP分型

根据限制性内切酶 Cla I的酶切情况,分为Ⅱ、Ⅳ、VV 3种基因型,LDL-R基因第 8外显子扩增片段为 176 bp,如有Cla I酶切位点,得到 147 bp、29 bp两条酶切片断;如无该酶切位点,则仅得到一条 176 bp的扩增带。因此,Ⅱ基因型存在 Cla I酶切位点,为 2条前移的电泳带:147 bp、29 bp,IV基因型为 3条电泳带:176 bp、147 bp、29 bp,VV基因型因突变 Cla I酶切位点消失,仅有一条 176 bp电泳带 (见图 1)。

2.3 3组受检者LDL-R基因 I334V突变基因型构成比与等位基因频率的比较 高胆固醇血症组 VV基因型频率显著高于边缘高胆固醇血症组及正常对照组,差异有统计学意义 (χ2值分别为 28.17和 24.50,P均 ＜0.01);且 V等位基因的频率亦显著高于边缘高胆固醇血症组及正常对照组,差异有统计学意义 (χ2值分别为 40.18和 44.15,P均 ＜0.01,见表 2)。

图 1 LDL-R基因第 8外显子 I334V突变的酶切电泳结果Figure 1 Electrophoretogram for Clal enzyme digestion in exon 8 of LDLR gene

表 1 高胆固醇血症组、边缘高胆固醇血症组和对照组 B MI及血脂水平比较 (±s)Table 1 Comparison of BMIand serum lipid levels among the three groups

表 1 高胆固醇血症组、边缘高胆固醇血症组和对照组 B MI及血脂水平比较 (±s)Table 1 Comparison of BMIand serum lipid levels among the three groups

注:BMI=体质指数,TC=总胆固醇,TG=三酰甘油,HDL-C=高密度脂蛋白胆固醇,LDL-C=低密度脂蛋白胆固醇;与正常对照组比较,*P＜0.05;与边缘高胆固醇血症组比较,△P＜0.05

组别 例数 BMI(kg/m2) TC(mmol/L) TG(mmol/L) HDL-C(mmol/L)LDL-C(mmol/L)正常对照组 350 25.1±2.2 3.96±0.47 1.03±0.29 1.49±0.31 2.24±0.36边缘高胆固醇血症组 420 27.4±2.9* 5.57±0.51* 0.99±0.30 1.26±0.32* 3.98±0.67*高胆固醇血症组 620 26.4±2.4* 8.13±0.87*△ 1.05±0.32 0.98±0.27*△ 6.27±0.71*△F值.17 P值 ＜0.01 ＜0.01 ＞0.05 ＜0.01 ＜0.01 81.89 6 208.1 2.83 256.32 4 699

表 2 3组 LDL-R基因第 8外显子 ClaI位点基因型和等位基因频率分布 [n(%)]Table 2 Frequencies of genotype and allele of the ClaI site polymorphism in exon 8 of LDL-R gene among the three groups

2.4 受检者 LDL-R基因 I334V突变基因型与血清脂质水平的关系 在Ⅱ、Ⅳ及 VV基因型组中,TC、LDL-C水平有逐步上升的趋势,组间两两比较差异均有统计学意义 (P＜0.05)。IV及 VV基因型组的 HDL-C水平显著低于Ⅱ基因型组,差异有统计学意义 (P＜0.05)。TG、VLDL水平在 3组之间差异无统计学意义 (P＞0.05,见表 3)。

2.5 LDL-R基因 I334V突变不同性别间各基因型血脂水平的比较 将所有的受检者按性别分组,然后对男性 (790例)、女性 (600例)各基因型血脂水平进行分析,结果显示 TC、HDL-C和 LDL-C水平在不同基因型间差异仍然有统计学意义 (P＜0.05,见表 4)。

表 3 LDL-R基因ClaI位点不同基因型血脂水平的比较 ( ±s,mmol/L)Tab le 3 Comparison of serum lipid levels among genotypes

表 3 LDL-R基因ClaI位点不同基因型血脂水平的比较 ( ±s,mmol/L)Tab le 3 Comparison of serum lipid levels among genotypes

注:VLDL=极低密度脂蛋白;与Ⅱ基因型组比较,*P＜0.05;与Ⅳ基因型组比较,△P＜0.05

基因型 例数 TC TG HDL-C LDL-C VLDLⅡ 1 289 6.05±1.25 0.99±0.31 1.31±0.28 4.44±1.66 0.96±0.39Ⅳ 50 7.44±1.39* 1.02±0.29 1.17±0.23*6.03±1.68* 0.98±0.35 VV 51 9.92±2.48*△ 1.03±0.37 1.11±0.25*8.32±2.25*△ 1.01±0.51 F值.36 P值 ＜0.01 ＞0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＞0.05 119.10 0.38 3.40 102.04 2

表 4 不同性别间 L DL-R基因 I 334V突变 3 种基因型血脂水平的比较 ( ±s,mmol/L)Tab le 4 Comparison of serum lipid levels among different genotypes in different genders

表 4 不同性别间 L DL-R基因 I 334V突变 3 种基因型血脂水平的比较 ( ±s,mmol/L)Tab le 4 Comparison of serum lipid levels among different genotypes in different genders

注:与Ⅱ基因型组比较,*P＜0.05;与Ⅳ基因型组比较,△P＜0.05;与 VV基因型组比较,#P＜0.05

性别 基因型 例数 TC TG HDL-C LDL-C VLDL男性 Ⅱ 730 6.06±1.36 0.98±0.31 1.22±0.24# 4.61±1.51 0.98±0.28 29 7.69±1.49* 0.96±0.28 1.20±0.18# 6.15±1.57* 1.01±0.23 VV 31 9.76±1.97*△ 0.96±0.30 1.08±0.28 8.40±1.75*△ 1.02±0.26 F值Ⅳ.76 P值 ＜0.01 ＞0.05 ＜0.05 ＜0.01 ＞0.05 135.8 0.10 3.31 95.77 0女性0.87±0.29Ⅳ21 7.09±1.57* 0.94±0.32 1.17±0.28# 5.57±1.51* 1.02±0.28 VV 20 10.17±2.05*△ 0.96±0.28 1.02±0.34 8.18±1.97*△ 0.98±0.26 F值Ⅱ559 5.63±1.50 0.92±0.27 1.29±0.34#△4.03±1.42.35 P值 ＜0.01 ＞0.05 ＜0.01 ＜0.01 ＞0.05 65.10 2.35 4.94 109.6 2

2.6 危险因素的 Logistic回归分析 将 TC作为因变量,年龄、性别、BMI、基因型、TG、HDL-C作为自变量,进行单因素 Logistic回归分析,发现年龄、TG、HDL-C、基因型有统计学意义 (P＜0.05);进一步以 TC作为因变量,年龄、基因型、TG、HDL-C作为自变量,行多因素 Logistic回归分析,发现基因型是危险因素 [VV基因型可增加高胆固醇血症的风险,OR=3.161,95%CI(2.389,4.059)],HDL-C是保护性因素 [OR=0.543,95%CI(0.333,0.887)](见表 5)。

表 5 各危险因素的 Logistic回归分析结果Table 5 Results ofmultiple logistic regression analysis

3 讨论

胆固醇水平异常是动脉粥样硬化和心脑血管疾病的重要危险因素。LDL-R的数量及功能对血浆胆固醇的含量起着至关重要的作用,LDL-R基因突变可引起 LDL-R结构功能改变,循环中 LDL清除障碍,从而出现高胆固醇血症、导致一系列心脑血管疾病[4]。近年来高胆固醇血症的发生率逐年上升,且年轻化趋势明显,严重威胁人类健康。因此,高胆固醇血症相关基因 LDL-R基因突变的研究也日益受到人们的重视。

LDL-R基因位于第 19号染色体短臂末端 (P13.1～13.3),全长 45 kb,分为 18个外显子和 17个内含子。LDLR基因存在多种基因多态性,本研究的 I334V突变是 LDL-R基因第 8外显子中第 355位密码子的第一个核苷酸 (第 1 063位碱基)由 A突变为 G,导致第 355位密码子由 ATC变为GTC,所编码的氨基酸由异亮氨酸 (Ile)变为缬氨酸 (Val),这是一个错义突变 (1063A＞G,I334V),使原有的 ClaⅠ酶切位点消失。

本研究发现 LDL-R基因 I334V突变与血清胆固醇水平的升高有着密切的联系。1997年 Pimstone等[5]的研究发现 I334V杂合子伴有中等程度升高的 TC水平、LDL-C水平以及 TC/HDL-C比值,说明 LDL-R基因突变与高胆固醇血症有关。本研究通过 PCR-RFLP的方法首次发现了 I334V突变的纯合子和杂合子,杂合子与纯合子的 TC、LDL-C水平明显高于无突变者,以纯合子升高更为明显,且 HDL-C的水平存在逐渐下降的趋势。

本研究还发现高胆固醇血症组的 I334V突变的 VV基因型及 V等位基因明显高于边缘高胆固醇血症组和对照组,而且随着Ⅱ、Ⅳ、VV基因型的变化,胆固醇的水平明显升高,且以女性 VV基因型的胆固醇水平升高最为明显,可能 VV基因型及 V等位基因与高胆固醇血症尤其是女性高胆固醇血症密切相关,但这一结论尚待更大规模的研究予以证实,其机制也有待进一步探讨。

回归分析发现 VV基因型是高胆固醇血症的主要危险因素,HDL-C为保护性因素,表明 LDL-R基因第 8外显子I334V突变可以影响血清胆固醇的水平,VV基因型是导致高胆固醇血症独立危险因素。

本研究证实 LDL-R基因的 I334V突变与血清胆固醇的水平关系密切,但目前仅进行了现象观察,其中的具体机制尚待进一步研究。

1 Alonso R,Mata N,Castillo S,et al.Cardiovascular disease in familialhypercholesterolaem ia:influence of low-density lipoprotein receptor mutation type and classic risk factors[J].Atherosclerosis,2008,200(2):315-321.

2 Snozek CL,Lagerstedt SA,Khoo TK,et al.LDLR promoter variant and exon 14mutation on the same chromosomeare associated with an unusually severe FH phenotype and treatment resistance[J].Eur JHum Genet,2009,17(1):85-90.

3 中国成人血脂异常防治指南制定联合委员会.中国成人血脂异常防治指南 [J].中华心血管杂志,2007,359(5):390-409.

4 夏军辉,王绿娅,蔺洁,等 .家族性高胆固醇血症并冠心病低密度脂蛋白受体基因突变分析 [J].实用儿科临床杂志,2008,23(1):25-27.

5 Pimstone SN,Defesche JC,Clee SM,etal.Differences in the phenotype between children with fam iliar defective apolipoprotein B-100 and familiar hypercholesterolemia[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,1997,17(5):826-833.

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低密度脂蛋白受体 (low density lipoprotein receptor,LDL-R)基因为一管家基因,分离并经逆转录得到的cDNA为5.3 Kb。在 LDL-R基因的任何部位出现异常都可致病。现已发现 150多种 LDL-R基因异常,但 90%以上的改变都不很大,只不过是一个或几个碱基发生异常而已。

LDL-R功能缺陷是引起高胆固醇血症及动脉粥样硬化 (AS)的主要原因之一。近几年来的研究发现,不仅家族性高胆固醇血症 (FH)是由于 LDL-R功能缺陷造成的,而且许多非家族性高胆固醇血症也可发生 LDL-R数量不足、程度不同的功能损伤,导致血浆中低密度脂蛋白胆固醇 (LDL-C)水平升高,形成 AS,这种 LDL-R的功能改变是由于轻微的遗传缺陷与环境因素综合引起的。因此,LDL-R功能缺陷受到越来越多的关注,其诊断和治疗的研究已成为当今医学领域研究的一个热点。随着分子生物学的发展,一些检测 LDL-R mRNA的方法相继出现,对 LDL-R基因表达水平与调控水平在 AS及冠心病中作用的认识不断深化,一些旨在增强LDL-R基因表达以降低血胆固醇水平的药物相继问世,高胆固醇血症的治疗已从过去的单纯对症治疗发展到增强受体活性及基因替代疗法。