α7烟碱受体拮抗剂对Aβ蛋白诱导损伤的PC12细胞保护作用的研究☆

汪志刚戚仁斌李卫沈文娟张晶赵彦儒朱丽红陆大祥

·论 著·

α7烟碱受体拮抗剂对Aβ蛋白诱导损伤的PC12细胞保护作用的研究☆

汪志刚*△戚仁斌△李卫※沈文娟△张晶△赵彦儒△朱丽红△陆大祥△

目的 观察α7烟碱受体拮抗剂对Aβ蛋白诱导损伤的PC12细胞远期影响，探讨其细胞保护的作用。方法 采用高分化的PC12细胞为研究对象，以Aβ25-35制作细胞损伤模型，以烟碱受体激动剂（尼古丁）和α7烟碱受体拮抗剂（甲基牛扁亭碱）进行预处理。试验分为4组，分别是：对照组（蒸馏水）、模型组（Aβ25-35）、尼古丁组（尼古丁和Aβ25-35）、甲基牛扁亭碱组（甲基牛扁亭碱和Aβ25-35）。通过 MTT比色法在多个时间点观察药物对细胞活力影响的动态变化，在此基础上采用流式细胞仪检测药物对细胞凋亡和坏死的影响。结果 在所有时间点，模型组的细胞活力均显著低于对照组，凋亡和坏死率均高于对照组（P＜0.01）。药物作用36～60 h，尼古丁组的细胞活力显著高于模型组和甲基牛扁亭碱组（P＜0.05），凋亡和坏死率较低（P＜0.01）；甲基牛扁亭碱组细胞活力及凋亡和坏死率与模型组差异无统计学意义。在药物作用84 h后，与模型组和尼古丁组相比，甲基牛扁亭碱组细胞活力显著升高，凋亡和坏死率显著降低（P＜0.01）。结论 随着作用时间的延长（84 h），烟碱受体激动剂（尼古丁）对PC12细胞的保护作用逐渐消失，而α7烟碱拮抗剂（甲基牛扁亭碱）逐渐显现出细胞保护作用。

β淀粉样蛋白 PC12细胞 α7烟碱受体拮抗剂 烟碱受体激动剂细胞活力 凋亡

神经型烟碱受体（nicotinic acetylcholine receptor，nAChR）在脑内广泛分布，与认知和记忆密切相关。阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）突出的临床表现是认知和记忆障碍，其重要病理特征是突触前神经元的丢失及其nAChR的减少，其中Aβ蛋白（β-Amyloid peptide）在发病过程中具有关键的作用［1］。α7型烟碱受体（α7 nAChR）与Aβ蛋白具有高度的亲和力［2］，可能介导了Aβ蛋白的神经细胞损伤作用。在AD的治疗中，乙酰胆碱酯酶抑制剂（acetylcholine esterase inhibitor，AChEI）是最常用的药物之一，其通过减少激动剂乙酰胆碱的分解起作用。临床研究发现，长期应用乙酰胆碱酯酶抑制剂其疗效逐渐丧失［3－4］，最后无异于安慰剂［5］；长期应用烟碱受体激动剂对神经细胞是否具有保护作用存在着矛盾的观点［6－7］。传统的观点认为短期应用烟碱受体拮抗剂不具有神经细胞保护作用［8－9］，而长期应用的研究结果说服力不足［10－11］。既然长期应用激动剂存在上述问题，那么长期应用烟碱受体拮抗剂可能会产生神经细胞的保护作用。

1 材料与方法

1.1 细胞培养 PC12细胞是类神经元，广泛用于神经系统疾病的研究，本实验高分化的PC12细胞购自中国科学院上海生科院细胞资源中心，其表面分布有多种nAChR，其中包括α7 nAChR。细胞培养液为含10%胎牛血清的RPMI-1640，于37℃、5%CO2条件下培养，选取对数生长期细胞进行实验。

1.2 药物与试剂制备 Aβ25-35（Sigma公司）配制母液浓度为1000 μmol／L，使用前置于37℃培养箱孵育3～7 d老化，作用浓度为10 μmol／L；尼古丁（nicotine，日本和光纯药株式会社）配制母液浓度2000 μmol／L，作用浓度100 μmol／L；甲基牛扁亭碱 （methyllycaconitine，Sigma公司）配制母液浓度200 μmol／L，作用浓度10 μmol／L；二者加入到培养液中的体积相等。

1.3 实验分组与药物处理 试验分为4组：对照组（加蒸馏水）、模型组（加 Aβ25-35）、尼古丁组（尼古丁预处理，12 h后再加 Aβ25-35）、甲基牛扁亭碱组（甲基牛扁亭碱预处理，12 h后再加Aβ25-35）。细胞活力检测：同时接种 5个 96孔培养板，细胞接种密度 500／孔；接种后约 24 h加入相应的药物预处理；12 h后全量换液加入Aβ25-35和相应的药物；每隔 24～36 h半量换液，并补充 Aβ25-35和相应的药物；分别于首次加药后 36、48、60、72、84 h进行细胞活力检测。细胞凋亡检测：同时接种2个24孔培养板；36 h实验细胞接种密度为20000／孔，84 h实验细胞接种密度为 1000／孔；药物处理方法同上；分别于首次加药后36 h和 84 h检测凋亡和坏死率。

1.4 检测方法 细胞活力检测：采用甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT；Sigma）比色法检测，浓度为5 mg／mL；每孔加入20 μL，在37℃培养箱孵育4 h；轻柔吸净培养孔中的液体，加入二甲基亚砜 （dimethyl Sulfoxide，DMSO；sigma）；震荡10 min，用多功能全波长酶标仪（瑞士Tecan公司）测定光吸收值（570 nm波长）。凋亡检测：消化收集处理后的细胞，PBS洗涤 2次，离心（2000 rpm，5 min）；调整的细胞数目为1～5×105，加入500 μL的Binding Buffer以悬浮细胞；加入5 μL Annexin V-FITC（南京凯基生物科技发展有限公司）混匀后，再加入5 μL碘化丙啶（Propidium，PI；南京凯基生物科技发展有限公司），混匀，室温避光反应5～15 min；在1 h内用FACS Aria流式细胞仪（美国BD公司）检测，激发波长488 nm，发射波长530 nm；重复5次实验。

1.5 统计学方法 使用SPSS 11.5统计软件分析和处理实验数据，数据以±s表示，采用单因素方差分析和LSD检验，检验水准α＝0.05。

表1 尼古丁或甲基牛扁亭碱作用不同时间后对PC12细胞活力的影响（±s）

表1 尼古丁或甲基牛扁亭碱作用不同时间后对PC12细胞活力的影响（±s）

1）与空白对照组比较，经LSD检验，P＜0.012）与模型组和甲基牛扁亭碱组比较，经LSD检验，P＜0.053）与模型组和尼古丁组比较，经LSD检验，P＜0.01

组别对照组模型组尼古丁组甲基牛扁亭碱组n 10 10 10 10 36 h 0.50±0.06 0.27±0.031）0.40±0.062）0.29±0.04 48 h 0.64±0.01 0.33±0.021）0.44±0.032）0.35±0.02 60 h 0.74±0.03 0.44±0.031）0.47±0.032）0.44±0.02 72 h 0.84±0.02 0.52±0.031）0.52±0.03 0.53±0.03 84 h 0.91±0.04 0.60±0.031）0.58±0.02 0.66±0.053）

图1 尼古丁或甲基牛扁亭碱对PC12细胞活力影响的动态变化趋势

表2 尼古丁或甲基牛扁亭碱作用于PC12细胞36 h和84 h后细胞的凋亡和坏死率比较

2 实验结果

2.1 尼古丁或甲基牛扁亭碱在不同时间点对PC12细胞活力的影响及其变化趋势 （见表1，图1）表1结果显示：在所有时间点，Aβ25-35组的细胞活力均显著低于对照组 （P＜0.01）。在36～60 h，尼古丁组细胞活力显著高于模型组和甲基牛扁亭碱组（P＜0.05）；甲基牛扁亭碱组与模型组的细胞活力差异无统计学意义。在72 h，模型组、尼古丁组和甲基牛扁亭碱组之间的细胞活力差异均无统计学意义。在84 h，甲基牛扁亭碱组的细胞活力显著高于模型组和尼古丁组（P＜0.01）。

图1结果提示：由于PC12细胞的具有增殖性，所以所有组别的细胞活力都是增加的。在所有时间点，模型组的细胞活力均明显低于对照组。尼古丁组细胞活力上升最为缓慢，最后甚至低于模型组；甲基牛扁亭碱组细胞活力上升最快，最后高于模型组和尼古丁组。

2.2 尼古丁或甲基牛扁亭碱作用于PC12细胞36和84 h后对细胞凋亡和坏死的影响 图2、3和表2结果提示：在两个时间段，模型组的细胞凋亡和坏死率均显著低于对照组（P＜0.01）。在36 h，尼古丁组的细胞凋亡和坏死率均显著低于模型组和甲基牛扁亭碱组（P＜0.01）；甲基牛扁亭碱组的细胞凋亡和坏死率与模型组差异无统计学意义。在8 4 h，尼古丁组的细胞凋亡和坏死率与模型组的差异无统计学意义；甲基牛扁亭碱组细胞凋亡和坏死率均显著低于模型组和尼古丁组（P＜0.01）。

3 讨论

Aβ蛋白可以诱导神经细胞的凋亡，在AD的发生发展中起到重要作用［12］。Aβ蛋白常常用于制作动物［13］或者细胞模型，用于AD的研究。有研究发现Aβ蛋白与α7 nAChR具有高度亲和力，Aβ蛋白在神经细胞内沉积可能与α7nAChR有关［2］。本实验发现Aβ25-35可引起PC12细胞活力下降，凋亡和坏死增加，为实验成功复制了Aβ蛋白的损伤模型。

本实验发现药物作用较短时间 （36～60 h）后，尼古丁可以对抗Aβ25-35的作用，提高PC12细胞的活力，抑制细胞的凋亡和坏死，具有细胞保护作用；同时，也发现在较短时间（36～60 h）的药物作用后，甲基牛扁亭碱未增加细胞活力，也未抑制细胞的凋亡。这些与以前的研究是一致的，同样采用PC12细胞，有研究发现乙酰胆碱类似物作用48 h，增加了细胞的活力［8］。还有采用SH-SY5Y细胞，用鱼藤酮毒和寡霉素A作用8 h，再加入α7烟碱受体激动剂作用16 h，细胞活力升高、凋亡坏死下降［9］。与激动剂相反，传统的观点认为烟碱受体拮抗剂不具有细胞保护作用，并且可能会阻断激动剂的保护作用［8－9］。

图2 流式细胞仪检测尼古丁或甲基牛扁亭碱作用36 h后的PC12细胞凋亡和坏死（各组PC12细胞凋亡和坏死率：A，对照组2.5%和3.2%；B，模型组8.9%和23.7%；C，尼古丁组2.7%和12.6%；D，甲基牛扁亭碱组7.3%和19.6%。

图3 流式细胞仪检测尼古丁或甲基牛扁亭碱作用84 h后PC12细胞的凋亡和坏死（各组PC12细胞凋亡和坏死率：A，对照组10.3%和7.2%；B，模型组51.0%和14.0%；C，尼古丁组51.5%和15.2%；D，甲基牛扁亭碱组41.2%和13.8%

但是在药物作用84 h后，与模型组相比，尼古丁组的细胞活力下降，凋亡和坏死增加，但差异无统计学意义；此时，与模型组和尼古丁组相比，甲基牛扁亭碱组的细胞活力显著较高，凋亡和坏死率显著较低。说明随着作用时间的延长，尼古丁对PC12细胞保护作用逐渐丧失，而甲基牛扁亭碱逐渐表现出细胞保护的作用。既往的文献报道，长期应用烟碱受体激动剂对神经细胞是否具有保护作用的观点存在着分歧。有研究认为长时间应用尼古丁（15 d）具有损伤神经细胞的作用［14］，也有研究认为尼古丁具有保护神经细胞的作用 （时间最长达6个月）［6－7］。根据本实验的结果，尼古丁的细胞保护作用随着作用时间的延长而消失，目前机理还不明确。有学者认为，尼古丁既可以促进细胞存活，也可以导致细胞凋亡，表现为促进存活和凋亡的两面性，和作用时间长短有一定关系［15］。Hu等［10］发现，Aβ蛋白早期仅仅影响神经元轴突的生长，而不影响细胞凋亡，用α7受体激动剂和拮抗剂预处理（6～9 d），均可以抑制Aβ蛋白的这种毒性作用。Mousavi等［11］在SH-SY5Y和M10细胞的实验中发现，用甲基牛扁亭碱和银环蛇毒（α-bungarotoxin）作用72 h，降低了Aβ蛋白的水平。此外，Martin等［16］在体外培养大鼠神经元的实验中发现，以甲基牛扁亭碱作用48 h，细胞活力是升高的。目前关于较长时间应用烟碱受体拮抗剂具有神经细胞保护作用的报道还较少，所观察到的结果仅仅是对轴突生长和Aβ蛋白水平的影响，或者检测指标过于简单（仅仅检测MTT）。但是，既然在AD的发病中，Aβ蛋白起到重要作用，并且Aβ蛋白在神经细胞内的沉积与α7烟碱受体可能有关；那么，α7烟碱受体拮抗剂通过阻断α7烟碱受体，可能会阻止Aβ蛋白对神经细胞的损伤，这些与本实验的结果是相符的。

在同样为受体的研究中，β受体激动剂短期治疗心衰有效，但长期用药却有害；而短期用β受体阻滞剂可能加重病情，长期用药却获益。与此类似，长期应用胆碱酯酶抑制剂（抑制激动剂乙酰胆碱分解）治疗AD，其疗效逐渐下降，最终无异于安慰剂［17］。并且，慢性心功能不全和AD具有类似的发病机制，如兴奋性的刺激、受体下调和减少、细胞凋亡。

综上所述，长期应用烟碱受体激动剂 （尼古丁）对PC12细胞的保护作用逐渐消失，是否具有不利的影响需要进一步研究；而长期应用α7烟碱受体拮抗剂（甲基牛扁亭碱）其细胞保护作用逐渐表现出来。结合文献报道，在AD治疗中，长期应用烟碱受体激动剂可能并不适宜，而α7烟碱受体拮抗剂可能成为一种好的选择，但还需要更多的证据。

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（责任编辑：李 立）

The study on protective effect of α7 nicotinic antagonist on PC12 cell injury induced by β-Amyloid peptides.

WANG Zhigang，QI Renbing，LI Wei，SHENG Wenjuan，ZHANG Jin，ZHAO Yanru，ZHU Lihong，LU Daxiang.Department of Critical Care Medicine，The First Affiliated Hospital，Jinan University，No.613 Huangpu Avenue West，Guangzhou 510630，China.Tel：020－38688319.

Objective To observe the long term effect of chronic administration of α7 nicotinic antagonist on PC12 cells injury induced by β-Amyloid peptides.Methods Well-differentiated PC12 cells were exposed to Aβ25-35 to create PC12 cell injury model and nicotine and methyllycaconitine were administrated before PC12 cell injury.The experimental groups were divided as follows：control（Distilled Water），model group（Aβ25-35），nicotine group（nicotine and Aβ25-35） and methyllycaconitine group （methyllycaconitine and Aβ25-35）.The cellar viability was detected using MTT chromatometry and the apoptosis and necrosis was detected by flow cytometer.Results Compared with control group，the cellular viability was decreased and apoptotic and necrotic rates were increased at every phase in model group（P＜0.01）.Compared with model and methyllycaconitine groups，the cellular viability was increased（P＜0.05）and apoptotic and necrotic rate were decreased in nicotine group（P＜0.01）between 36 and 60 h following treatment.There were no significant changes in cellular viability and apoptotic as well as necrotic rates between model and methyllycaconitine groups between 36 to 60 h following treatment.When treatment was prolonged to 48 h，there were no significant differences in cellular viability and apoptotic as well as necrotic rates between nico-tine and model groups.However，treatment with Methyllycaconitine for 48 h significantly increased cell viability and decreased apoptotic and necrotic rates compared with either model or nicotine groups （P＜0.01）.Conclusions When treatment is prolonged，the protective effect of nicotinic agonist（nicotine）decreases whereas the protective effect of α7 nicotinic antagonist（methyllycaconitine）increases.

β-Amyloid peptides PC12 cells nicotinic agonist nicotinic antagonist cellar viability apoptosis

R363

A

2011－02－25）

☆ 广东省自然科学基金项目（编号：845106320100363），暨南大学科研培育与创新基金前瞻性与基础研究项目（中央高校基本科研业务费专项资金资助，编号：21609425）

* 暨南大学附属第一医院危重病医学科（广州 510630）

△ 暨南大学医学院病理生理学系，国家中医药管理局病理生理重点实验室

（E-mail：ldx＠jnu.edu.cn）

※ 暨南大学附属第一医院神经外科