应用多粘菌素B与甘氨酸拮抗疫苗内毒素作用的研究

袁明霞，赵辉

（哈药集团生物疫苗有限公司，黑龙江哈尔滨 150069）

革兰氏阴性菌疫苗在生产过程中常出现因配制工艺、抗生素不当应用引起菌体崩解，导致内毒素释放，使注射动物出现一系列临床反应：肿头，肿脸，停食停水，局部炎症，休克，死亡；生产性能降低；免疫功能下降，易发病，对疫苗应答下降。有研究报道甘氨酸（Gly）能显著拮抗内毒素的致热性，能在一定程度上破坏内毒素的超微结构，从而干扰其活性；而多粘菌素B（PMB）是有效的内毒素拮抗剂。本试验联合应用甘氨酸和多粘菌素B，确定其在仔猪水肿病多价灭活疫苗中拮抗内毒素释放的效果，并找出二者的最佳配合比例。

一、材料与方法

表1 PMB+Gly联合应用效果实验分组情况

（一）试验材料

1.猪大肠杆菌生产菌种。猪大肠杆菌C83684、C83905、C83902株，购自中国兽医药品监察所，ED0301菌株由哈药集团生物疫苗有限公司分离鉴定。

2.培养基。营养琼脂平板和营养肉汤按《兽药典》附录方法制备。

3.试验动物。体重为16～18 g小鼠和14日龄健康易感仔猪，由哈药集团生物疫苗有限公司实验动物

中心提供。

（二）试验方法

1.猪大肠杆菌菌液制备。将各菌株分别接种于营养琼脂平板复苏培养，按“规程草案”方法制备生产用二级菌种，以5%接种于含0.5%甘油营养肉汤中，逐渐增大通气量，于37℃通气培养18 h，然后分别取样，测定菌液中细菌数量。

表2 疫苗中联合应用PMB+Gly对小鼠的作用效果

2.菌液浓缩与灭活。取检验合格的猪大肠杆菌灭活菌液经4 000 r/min，离心30 min，弃去7/8上清液后，将菌体悬浮，按《兽药典》附录方法进行活菌计数，将各菌株菌液按1:1:1:1比例混合后，按总量0.4%加入甲醛溶液，经37℃灭活48 h，其间每间隔2～4 h搅拌1次，然后取灭活菌液接种营养琼脂平板，每个样品接种3个平板，每个平板接种0.2 ml，置37℃培养48 h，检查有无细菌生长。

3.疫苗的制备。在检验合格的灭活菌液中加入终浓度为的20%氢氧化铝凝胶和0.005%的硫柳汞防腐，制备浓缩灭活疫苗含单株菌数均不低于100×108 CFU/ml（按灭活前活菌数计算）。

4.多粘菌素B与甘氨酸的配制。用灭菌生理盐水配制储存浓度为200μg/ml的多粘菌素B和200 mg/ml的甘氨酸，分别用0.22μm的滤膜过滤，置于4℃保存。

5.疫苗中PMB+Gly联用对小鼠毒性的观察。选取16～18 g小鼠55只，随机分成11组，5只/组：其中组1腹部皮下接种疫苗0.1 ml/只；另9组分别按表1中比例接种疫苗+PMB+Gly，0.1 ml/只；同时设立生理盐水对照组，0.1 ml/只。观察7 d，记录注苗反应和临床表现。

6.疫苗中PMB+Gly联用对仔猪的安全性比对试验。选取14日龄健康仔猪15头，随机分成3组，5头/组，测定每组仔猪的直肠体温，并计算其平均值。然后分别接种疫苗4 ml、含有PMB(2μg/ml)和Gly（20 mg/ml）的疫苗4 ml、以及生理盐水4 ml。分别于12 h、24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h和168 h测定各仔猪的直肠体温，计算每组仔猪体温的平均值，并观察其临床表现。

7.疫苗中PMB+Gly联用对仔猪的免疫原性比对试验。选取14日龄的健康易感仔猪10头，随机分成2组，将5头/组，分别颈部肌肉接种制备的两组疫苗2 ml/只，另3头设为对照组，接种等剂量的生理盐水2 ml/只。至21 d各耳静脉注射一个致死量的混合毒素，观察10 d，记录仔猪的发病和死亡情况。

二、结果

1.活 菌 计 数。C83684、C83905、C83902和ED0301菌株计数结果分别为128×108CFU/ml、125×108CFU/ml、159×108CFU/ ml、131×108CFU/ml。

2.疫苗中PMB+Gly联合应用效果的比对试验结果。仅接种疫苗的小鼠24 h内出现眼部肿胀、部分小鼠全身肌肉震颤，在48 h内死亡3/5。

接种含有PMB+Gly的小鼠死亡率出现明显下降，当PMB和Gly的浓度分别为2μg/ml和20 mg/ml时，二者达到最佳配合比例，小鼠未见死亡，且无可见临床反应；当二者浓度过高时，个别小鼠出现颤抖的神经症状。具体结果详见表2。

3.疫苗中PMB+Gly联用对仔猪的安全性比对试验结果。3组14日龄仔猪分别接种疫苗4 ml、含有PMB(2μg/ml)和Gly（20 mg/ml）的疫苗4 ml、以及生理盐水4 ml后，连续7 d测定每组仔猪直肠体温，并计算其平均值，如表3。

结果表明：仅接种生理盐水的仔猪体温不高于39.0℃；只接种疫苗组仔猪体温逐渐升高，48 h体温升至最高40.1℃，此后逐渐降低，至168 h（7 d）体温仍较其它两组高；接种疫苗+ PMB+Gly的仔猪体温也逐渐升高，72 h体温升至最高39.4℃，7 d后逐渐接近正常体温，远远低于仅接种疫苗组，说明PMB+Gly可以协同拮抗疫苗内毒素引起的体温升高。

4.疫苗中PMB+Gly联用对仔猪免疫原性的比对试验结果。结果表明接种疫苗+PMB+Gly组仔猪的攻毒保护为4/5，与仅免疫疫苗组的攻毒保护率相同，而对照组仔猪全部死亡，详见表4。说明含有PMB+Gly不影响疫苗的免疫效力。

表3 仔猪体温平均变化情况

表4 对仔猪的免疫原性比较

三、讨论

内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁上一种大分子有机化合物，主要成分为脂多糖，其结构具有高度的稳定性，160℃需2～4 h才能灭活。在革兰氏阴性菌疫苗的制备过程中因培养、离心、配制等工艺使得菌体崩解，从而引起内毒素释放，动物免疫后，常出现肿头，肿脸，停食停水，局部炎症，休克，死亡；生产性能降低；免疫功能下降，易发病，对疫苗应答下降等临床反应。

多粘菌素B（PMB）是一种环形阳离子多肽，被认为是惟一具有抗内毒素作用的抗生素，与LPS的活性中心Lipid A具有很高的亲和力，直接与Lipid A的SO42-结合，抑制LPS的生物活性，发挥对内毒素的中和作用。

甘氨酸（Gly）是机体固有的最简单的氨基酸，具有两性游离的特点，通过其氨基与内毒素结合而改变了内毒素正常结构，也可抑制内毒素诱导的IL-1、TNF的分泌，降低内毒素与单核细胞的结合率，

国内外的研究结果表明，选择分别作用于内毒素分子结构中的不同部位的两种拮抗剂同时应用，或者利用两种拮抗剂同时阻断内毒素作用的多个环节，会取得更理想的效果，并且两种拮抗剂同时应用，还可因减少单一拮抗剂的用量而降低药物的毒副作用。

根据这个思路，我们选定了Gly与PMB联合作用于仔猪水肿病多价灭活疫苗，试验证实二者联用能够较为明显的协同拮抗疫苗中内毒素对小鼠的致死作用和对仔猪的致热性作用，并确定了Gly与PMB的最佳协同比例。Gly与PMB联合应用于仔猪水肿病多价灭活疫苗的尝试，为其它革兰氏阴性菌疫苗的开发开辟了一条新的研究思路。

（略）