乳铁蛋白素B和天蚕素P1对投喂大肠杆菌断奶仔猪生长及肠道微生物区系的影响

侯振平 印遇龙 王文杰 刘景喜 SOUFFRANTW B

(1.天津市畜牧兽医研究所，天津 300112;2.中国科学院亚热带农业生态研究所，长沙 410125;3.德国家畜生物研究所，Dummerstorf D- 18196)

乳铁蛋白素B和天蚕素P1对投喂大肠杆菌断奶仔猪生长及肠道微生物区系的影响

侯振平1印遇龙2王文杰1刘景喜1SOUFFRANTW B3

(1.天津市畜牧兽医研究所，天津 300112;2.中国科学院亚热带农业生态研究所，长沙 410125;3.德国家畜生物研究所，Dummerstorf D- 18196)

本研究旨在探讨投喂大肠杆菌后乳铁蛋白素B(Lfcin B)和天蚕素P1(Cec P1)对断奶仔猪生长及肠道微生物区系影响。选用48头28日龄断奶的德国大白杂交二代断奶仔猪［(7.18±1.32)kg］，根据体重、窝别、性别将其随机分成 4 组:对照组、产肠毒素组(ETEC)、乳铁蛋白素组(Lfcin B)、天蚕素组(Cec P1)，每组2个重复，每个重复6头猪，试验期为12 d。结果表明，1)试验期间对照组、ETEC组、Lfcin B组、Cec P1组仔猪体重及平均日增重均差异不显著(P＞0.05)。2)ETEC组仔猪腹泻率显著高于其他组(P＜0.05)，而其他组之间差异不显著(P＞0.05)。在进行第1次攻毒后，即仔猪29日龄，ETEC组、Lfcin B组和Cec P1组仔猪的粪便干物质均显著下降(P＜0.05)，第2次攻毒后的第2天，即仔猪31日龄，Lfcin B组和Cec P1组的仔猪分别饲喂了Lfcin B和Cec P1，对照组仔猪的粪便干物质仍显著高于ETEC组和Lfcin B组(P＜0.05)，但已与Cec P1组差异不显著(P＞0.05)。3)各组仔猪的肠道微生物区系差异不显著(P＞0.05)。由此可知，各组仔猪生长及肠道微生物区系差异不显著，但Cec P1来源于猪肠道微生物寄生线虫，比Lfcin B更能适应肠道环境，更有利于仔猪健康。

Lfcin B;Cec P 1;ETEC;断奶仔猪;肠道;微生物区系

乳铁蛋白素B(lactoferricin B，Lfcin B)是从牛乳铁蛋白(bovine lactoferrin，BLF)的 N端(17～41)被胃蛋白酶水解下来的25个氨基酸残基，其中的11个氨基酸残基具有与完整的Lfcin B相同的抗菌活性，虽然没有铁离子结合位点，但杀菌活性甚至比乳铁蛋白(LF)高［3-5］。天蚕素 P1(cecropin P1，Cec P1)是第1个从猪肠微生物寄生虫中分离出的抗菌肽［6］，由31个氨基酸组成，其氨基酸序列为SWLSKTAKKLENSAKKRISEGIAIAIQGGPR，与昆虫Cec A和Cec B分别有64%和75%的相似性。

目前有很多关于Lfcin B和Cec P1的表达载体构建和体外活性测定［7-17］，但关于Lfcin B在动物生产应用上的报道很少，甚至没有关于Cec P1在动物生产应用上的报道，更是鲜有Lfcin B和Cec P1在动物生产应用上的比较。本研究旨在通过研究投喂大肠杆菌后Lfcin B和Cec P1对断奶仔猪生长及肠道微生物区系的影响，为抗菌肽在动物生产中的应用提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 试验动物及饲粮

试验选用28日龄的德国大白杂交二代断奶仔猪［(7.18 ±1.32)kg］48 头，其饲粮由德国家畜微生物所动物营养与生理研究室提供，基础饲粮组成及营养水平见表1，Lfcin B和Cec P1浓度均为1 mg/μL，由德国基因桥公司提供。

1.2 试验设计、饲养管理及样品采集

根据体重、窝别、性别将48头断奶仔猪随机分成4组:对照组、产肠毒素组［饲喂肠产毒性大肠 埃 希 菌 (enterotoxigenicEscherichiacoli，O149∶K91∶F4ac)，ETEC 组］、乳铁蛋白素组(Lfcin B组)、天蚕素组(Cec P1组)，每组2个重复，每个重复6头猪，试验期为12 d。试验的第1、2天(即仔猪28、29日龄)禁食，自由饮水。

表1 基础饲粮组成及营养水平Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet

每天08:00和16:00饲喂，自由饮水，记录饲料剩余情况和粪指数(评判方法:水样粪便为 1;软而成型为 2;坚硬为 3;非常坚硬为4)、腹泻情况(粪指数为1～2，包括1，定为腹泻)、死亡头数，并逐只称重，计算腹泻率和平均日增重。除试验第1天(28日龄)不采集粪样外，以后每天都采集新鲜粪样，-20℃保存，以备测定粪便干物质含量及提取DNA。

1.3 攻毒试验

在仔猪29日龄的08:00，除对照组的仔猪外，ETEC组、Lfcin B组、Cec P1组的每头仔猪饲喂4.2 ×109CFU/m L ETEC。

伴随着e航海战略的发展，MS服务必将朝着协调统一、安全高效、单一窗口的方向发展。在这一发展进程中，航海保障部门无论是从国家政策、战略布局，还是技术理论及角色定位等方面，理应担负起MS服务区域协调人的角色。在协调各方信息资源的同时，更好地实施e航海战略，推进智能化助航服务的发展。

在仔猪30日龄06:00开始提供饲料，在给ETEC、Lfcin B、Cec P1饲喂 5.5×109CFU/m L 的ETEC 2 h后(08:00)，用一次性注射器给Lfcin B组的每头仔猪口服饲喂2 mg Lfcin B，Cec P1组的每头仔猪口服饲喂2 mg Cec P1。

1.4 样品分析

1.4.1 干物质的测定

称取1 g新鲜的粪样于陶瓷平皿中，放入恒温烘箱，60℃烘24 h，然后再105℃烘3 h，称量剩余物质的重量。

1.4.2 DNA提取、浓度测定及样品处理

取200 mg新鲜粪样，按照试剂盒的操作说明进行细菌总DNA提取，使用美国NanoDropND-1000 DNA/RNA/蛋白质浓度测定仪测DNA浓度，根据浓度大小及稀释倍数，换算成待测DNA浓度，并把管中DNA作相应稀释，以20 ng/μL分装，于-20℃保存。根据记录的A260/A230，估测 DNA 质量，一般 A260/A280 在 1.6 ～1.8，蛋白质含量为0时可以满足本试验要求。样品分析采用的是每天每组每头猪粪样DNA按照浓度1∶1的比例混合而成的样品。

1.4.3 肠道微生物区系的测定

本试验参考 Nübel等［18］和 Felske 等［19］发表的引物，引物 S-D-Bact-0008和 Uni-1492-R用作PCR-16S rRNA扩增，S-D-Bact-0968-GC和 S-DBact-1401用作PCR-DGGE扩增。引物由英国Invitrogen生物公司合成，超纯水溶解，-20℃保存。

用nested-PCR进行16S rRNA扩增，按照前人报道的方法［20-21］进行DGGE的配制和电泳及胶的染色、照相。每个样品都重复3次，然后取平均值。

1.5 统计分析

试验得到的图片用BioNumerics 5.0进行分析，然后用 Canoco 4.5［22-23］统计分析得到的数据，数值以平均值±标准差表示，并用Statistica 6.0［24］(ANOVA HSD-test)进行差异性显著分析，P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异极显著。

2 结果

2.1 L fcin B和Cec P1对断奶仔猪体重和平均日增重的影响

由表2可知，对照组、ETEC组、Lfcin B组和Cec P1组仔猪体重和平均日增重差异不显著(P＞0.05)。但在仔猪29～30日龄攻毒期、31～39日龄恢复期及整个试验阶段来看，对照组仔猪保持较高的平均日增重，Cec P1组次之。

2.2 L fcin B和Cec P1对断奶仔猪腹泻的影响

给28日龄断奶仔猪投喂大肠杆菌后，Lfcin B和Cec P1对仔猪腹泻的影响分别见表3、图1和表4。

由表3可见，ETEC组仔猪腹泻率显著高于其他组(P＜0.05)，而其他组之间差异不显著(P＞0.05)。从图1可知，Lfcin B、Cec P1对粪指数的影响不显著(P＞0.05)。由表4可以看出，在进行第1次攻毒后，即仔猪29日龄，ETEC组、Lfcin B组和Cec P1组仔猪的粪便干物质均显著下降(P＜0.05)，说明本试验进行了比较成功的攻毒试验。在进行第2次攻毒后的第2天，即仔猪31日龄，Lfcin B组和Cec P1组的仔猪分别饲喂了Lfcin B和Cec P1，其粪便干物质含量开始有所回升，对照组仔猪的粪便干物质仍显著高于ETEC组和Lfcin B组(P＜0.05)，但已与Cec P1组差异不显著(P＞0.05)。

2.3 Lfcin B和Cec P1对断奶仔猪肠道微生物区系多样性的影响

2.3.1 PCR-16S rRNA 扩增结果

从新鲜粪样中提取细菌总DNA，进行PCR-16S rRNA的v6～v8区PCR扩增，将扩增的PCR产物经1.5%的琼脂糖凝胶检测，扩增产物长度为1 484 bp(图 2)。

表2 Lfcin B和Cec P1对断奶仔猪体重和平均日增重的影响Table 2 Effects of Lfcin B and Cec P1 on body weight and average daily gain of weaned piglets

表3 L fcin B和Cec P1对断奶仔猪腹泻率的影响Table 3 Effects of Lfcin B and Cec P1 on diarrhea rate of weaned piglets

图1 L fcin B和Cec P1对断奶仔猪粪指数的影响Fig.1 Effects of Lfcin B and Cec P1 on feces score of weaned piglets

表4 L fcin B和Cec P1对断奶仔猪粪便干物质含量的影响Table 4 Effects of Lfcin B and Cec P1 on the content of dry matter of feces in weaned piglets %

图2 PCR-16S rRNA扩增产物Fig.2 PCR product of PCR-16S rRNA

2.3.2 PCR-DGGE 扩增结果

以PCR-16S rRNA扩增产物为模板，进行PCR-DGGE扩增，将扩增的PCR产物经1.5%的琼脂糖凝胶检测，扩增产物长度为433 bp(图3)。

图3 PCR-DGGE扩增产物Fig.3 PCR product of PCR-DGGE

2.4 Lfcin B和Cec P1对断奶仔猪肠道微生物区系多样性的影响

2.4.1 DGGE 电泳结果代表图

图4是以PCR-16S rRNA扩增产物为模板，进行PCR-DGGE扩增，将扩增的PCR产物经55%PAGE、1×TAE、60℃ 16 h电泳的结果。

2.4.2 微生物区系多样性统计分析结果

肠道微生物区系的多样性，用以下几种多样性进行描述:N2 diversity［23-24］:有效物种出现率;N1 richness:物种丰度(计算公式为N1=eH，H为Shannon’s diversity);N2/N1:特定样品的平均组成;Number of species:样品的丰度;Shannon’s diversity:大量单个物种的相对比例(计算公式为H=-Σpjlog(pj)，pj=Yj/SUM。SUM 为一个样品的物种值的总和，Yj为样品中第j个物种的数量)。

微生物区系多样性统计结果见图5、图6、图7、图8。由图可知，各组仔猪肠道微生物区系差异不显著(P＞0.05)。不同日龄聚类分析结果见图9，表明日龄对肠道微生物区系的多样性起着相对的决定作用。

图4 全组样DGGE结果代表图Fig.4 Representative images of denaturing gradient gel electrophoresis of real pool samples

图5 样品中有效物种出现率Fig.5 N2 diversity(effective species occurrences)of samples

图6 样品中特定样品的平均组成Fig.6 N2/N1 evenness(compositional evenness of particular sample)of samples

图7 样品中物种的丰度Fig.7 Number of species(sample richness)of samples

图8 样品中大量单个物种的相对比例Fig.8 Shannon’s diversity(relative proportions of abundances of individual species)of samples

图9 样品聚类分析图Fig.9 Cluster analysis of samples

3 讨论

Lfcin B来源于乳铁蛋白素(Lfcin)的酶解，而Lfcin存在于人及大多数哺乳动物的乳汁中，也存在于唾液、泪液、胰液以及其他的身体分泌物中。Cec P1是第1个从猪肠分离的抗菌肽，后经研究者证实，Cec P1来源于猪肠道的寄生线虫(Ascaris suum)［25］。因此，外源性添加Cec P1应该比Lfcin B对猪肠道微生物的影响要大。体外试验结果也表明，Lfcin B对来源于猪的ETEC的最小抑制浓度 (m inimum inhibition concentration，M IC)是8μg/m L，而Cec P1的M IC是6μg/m L。

仔猪在断奶初期3～5 d，会出现腹泻、食欲下降、生长停滞等断奶综合征，需要采取必要的措施缓解这种断奶应激，使断奶仔猪早日进入生长肥育角色，提高养猪生产效率。Wang等［26-27］研究表明，当乳铁蛋白与抗生素结合使用时，可以显著提高断奶仔猪的生长性能，降低腹泻率，增加绒毛高度，降低隐窝深度。从本试验结果可以看出，Cec P1对投喂大肠杆菌的断奶仔猪早期生长性能的影响优于Lfcin B，添加Cec P1更有利于仔猪从病理状态恢复到正常生长状态。本试验的目的之一就是研究抗菌肽是否可以有效地降低仔猪断奶腹泻，从而缓解断奶应激。从对断奶仔猪腹泻率、粪指数和粪便干物质含量的比较分析来看，添加抗菌肽Cec P1有降低仔猪腹泻的趋势，且Lfcin B组与对照组保持相同的腹泻率(23%)。在后期恢复阶段，Cec P1表现出更强的优势。由此可见Cec P1更有利于帮助断奶仔猪度过早期断奶综合征阶段。而本试验中，除了对断奶仔猪投喂ETEC外，并没有结合抗生素使用，所以无法比较单独使用Lfcin B、Cec P1与Lfcin B和抗生素及Cec P1和抗生素结合使用的效果。

有研究报道，乳铁蛋白可以保护新生小鼠免受与肠道有关的系统性感染［28］。本试验中，虽然对照组、ETEC组、Lfcin B组和Cec P1组投喂了大肠杆菌的断奶仔猪肠道微生物区系的多样性差异不显著，但从整个试验期微生物区系多样性的变化趋势来看，Lfcin B和Cec P1有利于保护投喂了大肠杆菌的仔猪肠道内的有益微生物，维持相对正常的微生物区系，且Cec P1有优于Lfcin B的趋势。

在整个试验过程中，对照组仔猪保持相对高的平均日增重、粪指数、粪便干物质含量和相对丰富的微生物多样性，而Cec P1次之，且有较低的腹泻率，这点表明，Cec P1具有较强的抗菌性能，有助于仔猪生长发育。

4 结论

① 对照组、ETEC组、Lfcin B组和Cec P1组仔猪的生长及肠道微生物区系差异不显著，但在某种程度上，抗菌肽能够改善断奶仔猪的生长性能，控制腹泻率，提高粪便干物质及粪指数，缓解断奶应激。

②Cec P1来源于猪肠道微生物寄生线虫，比Lfcin B更能适应肠道环境，更有利于仔猪健康。

［1］温刘发，何丹林，张常明，等.抗菌肽酵母制剂的生产及其作饲料添加剂应用价值的探讨［J］.广东蚕业，2001，35(2):34-36.

［2］温刘发，何丹林，张常明，等.抗菌肽酵母制剂作为饲料添加剂的应用前景［J］.中国饲料，2001(23):22-23.

［3］BELLAMY W，TAKASE M，YAMAUCHI K，et al.Identification of the bactericidal domain of lactoferrin［J］.Biochim ica Biophysica Acta，1992，1121:130-136.

［4］冯兴军，王建华，杨雅麟，等.乳铁蛋白肽(Lactoferricin)作用机制研究进展［J］.中国生物工程杂志，2004，1:23-26.

［5］JONES E M，SMART A，BLOOMBERG G，et al.Lactoferricin，a new antim icrobial peptide［J］.The Journal of Applied Bacteriology，1994，77:206-214.

［6］VMAR DAHET M.Antibacterial and antifungal activity of small protein ofIndigofera oblongifolialeaves［J］.Journal of Ethnopharmacology，1999，64:277-282.

［7］JONES E M，SMART A，BLOOMBERG G，et al.Lactoferricin，a new antim icrobial peptide［J］.The Journal of Applied Bacteriology，1994，77:206-214.

［8］VLADIM IR S，KELLIE S，GREGOR R.Activity of cecropin P1 and FA-LL-37 against urogenital m icroflora［J］.Microbes and Infection，2000，2:773-777.S1286457900003592/FLA.

［9］丁兆忠，苗向阳，孙世铎，等.抗菌肽Cecropin P1基因真核表达载体的构建［J］.黑龙江畜牧兽医，2006，6:12-14.

［10］王爱苹，汪以真，陈正贤.猪抗菌肽cecropin-P1单克隆抗体的制备［J］.上海畜牧兽医通讯，2008，4:36-38.

［11］ELLISON R T，GIEHL T J.Killing of gram-negative bacteria by lactoferrin and lysozyme［J］.The Journal of Clinical Investigation，1991，88:1080-1091.

［12］PIERCE A D，COLAVIZZA M，BENAISSA，etal.Molecular cloning and sequence analysis of bovine lactotransferrin［J］.European Journal of Biochem istry，1991，196:177-184.

［13］DIONYSIUS D A，GRIEVE P A，M ILNE J M.Forms of lactoferrin:their antibacterialeffecton enterotoxigenicEscherichia coli［J］.Journal of Dairy Science，1993，76:2597-2606.

［14］BOMAN H G， AGERBERTH B， BOMAN A.Mechanisms of action onEscherichia coliof cecropin P1 and PR-39，two antibacterial peptides from pig intestine［J］.Infection and Immunity，1993，61(7):2978-2984.

［15］DIONYSIUSD A，M ILINE JM.Antibacterial peptides of bovine lactoferrin:purification and characterization［J］.Journal of Dairy Science，1997，80:667-674.

［16］ELIASSEN L T，BERGE G，SVEINBJORNSSON B，et al.Evidence for a direct antitumor mechanism of action of bovine lactoferricin［J］.Anticancer Research，2002，22(5):2703-2710.

［17］李铁晶，黄占权，许岩.抗菌肽Lactoferricin基因的PCR合成及克隆载体T-Lfn的构建［J］.东北农业大学学报，2008，39(1):107-111.

［18］NÜBEL U，ENGELEN B，FELSKE A，et al.Sequence heterogeneities of genes encoding 16S rRNAs inPaenibacillus polymyxadetected by temperature gradientgel electrophoresis［J］.Journal of Bacteriology，1996，178:5636-5643.

［19］FELSKE A，AKKERMANS A D，DE VOSW M.Quantification of 16S rRNA in complex bacterial communities by multiple competitive reverse transcription-PCR in temperature gradientgel electrophoresis fingerprints［J］.Applied and Environmental Microbiology，1998，64:4581-4587.

［20］KONSTANTINVO S R，AWATI A，SM IDT H，et al.Specific response of a novel and abundantLactobacillusamylovorus-like phylotype to dietary prebiotics in guts of weaning piglets［J］.Applied and Environmental Microbiology，2004，70:3821-3830.

［21］JANCZYK P，PIEPER R，SM IDT H，etal.Changes in the diversity of pig ileaLactobacilliaround weaning determ ined by means of 16S rRNA-gene amplification and denaturing gradient gel electrophoresis［J］.FEMS Microbiology Ecology，2007，61(1):132-140.doi:10.1111/j.1574-6941.2007.00317.

［22］ŠM ILAUER P.Canoco reference manual and Cano-Draw for W indow s user’s guide biometrics［M］.Netherland:Wageningen and Cˇeske.Budějovice，2002.

［23］MAGURRAN A E.Measuring biological diversity［M］.1sted.Oxford，UK:Blackwell Science Ltd.，2004.

［24］STATISTICA 6.0.StatSoft［CP/DK］.Tulsa，USA，2005.

［25］AJITHA P，SATOSHIU，HONG Z，et al.Cecropin P1 and novel nematode cecropins:a bacteria-inducible antim icrobial peptide fam ily in the nematodeAscaris suum［J］.Biochem istry Journal，2005，390:207-214.(Printed in Great Britain)doi:10.1042/BJ20050218.

［26］WANG Y Z，SHAN T Z，XU Z R，et al.Effect of lactoferrin on the growth performance，intestinalmorphology，and expression of PR-39 and protegrin-1 genes in weaned piglets［J］.Journal of Animal Science，2006，84:2636-2641.doi:10.2527/jas.2005-544.

［27］WANG Y Z，SHAN T Z，XU Z R，et al.Effects of the lactoferrin(LF)on the growth performance，intestinalm icroflora and morphology of weanling pigs［J］.Animal Feed Science and Technology，2007，135:263-272.doi:10.1016/j.anifeedsci.2006.07.013.

［28］LYNN E，HIPOLITO R B，HWANG F Y，et al.Lactoferrin protects neonatal rats from gut-related system ic infection［J］.American Journal of Physiology-Endocrinology，Metabolism and Gastrointestinal Physiology，2001，281:G1140-G1150.

Author，HOU Zhenping，assistant professor，E-mail:hzp2006@126.com

(编辑 何丽霞)

Effects of Lactoferricin B and Cecropin P1 on G row th and Gut Microflora in Weaned Piglets Challenged with EnterotoxigenicEscherichia coli

HOU Zhenping1YIN Yulong2WANG Wenjie1LIU Jingxi1SOUFFRANTW B3
(1.Tianjin Institute of Husbandry and Veterinary Science，Tianjin300112，China;2.Institute of Subtropical and Agriculture，The Chinese Academy Sciences，Changsha410125，China;3.Leibniz Institute for Farm Animal Biology，Dummerstorf D-18196，Germany)

This experiment was conducted to study the effects of lactoferricin B(Lfcin B)and cecropin P1(Cec P1)on growth and gutm icroflora in weaned piglets after orally challenged with enterotoxigenicEscherichia coli(ETEC).Forty-eight28-day-old German Landrace×German Landraceweaned pigletswith average body weight of(7.18 ±1.32)kg were random ly assigned tofour dietary treatments(the control，ETEC，LfcinB，Cec P1)with two replicates per treatmentand six pigs per replicate.The feeding trial lasted for 12 days.The results showed as follows:1)there were no significant differences in body weight and average daily gain among control，ETEC，Lfcin B and Cec P1 group(P＞0.05).2)The incidence of diarrhea in ETEC group was significantly higher than that in the other groups(P＜0.05)，but there was no significant difference among control，Lfcin B and Cec P1 group(P＞0.05).A fter challenged with ETEC firstly，the content of dry matter in feces of 29-day-old weaned piglets in ETEC，Lfcin B and Cec P1 group was significantly decreased(P＜0.05)，and after challenged with ETEC secondly，the content of dry matter in feces of 31-day-old weaned piglets in ETEC and Lfcin B group was still significantly lower than that in the control group(P＜0.05)，but there was no significant difference between the control group and Cec P1 group.3)There was no significant difference in gutm icroflora among all groups(P＞0.05).In conclusion，there are no significant differences in the growth and gutm icroflora of weaned piglets among the control，ETEC，Lfcin B and Cec P1 group，however，because Cec P1 is separated from nematodeAscaris suumof gutm icrobe in pigs，it lives more easily in the gut than Lfcin B，and it ismore favourable to the health of piglets.［Chinese Journal of Animal Nutrition，2011，23(9):1536-1544］

Lfcin B;Cec P 1;ETEC;weaned piglet;gut;m icroflora

S816.7

A

1006-267X(2011)09-1536-09

10.3969/j.issn.1006-267x.2011.09.012

2011-03-17

国家863项目(2008AA10Z316);国家自然科学基金面上项目(30700581);中德联合培养博士项目

侯振平(1978—)，女，河南扶沟人，助理研究员，博士，主要研究方向为微生物与营养。E-mail:hzp2006@126.com