不同水平精氨酸-甘氨酸-谷氨酰胺对断奶仔猪空肠体外酶活及细胞增殖与凋亡的影响

蒋 义 贾 刚 黄 兰 吴彩梅 王康宁

(四川农业大学动物营养研究所，雅安 625014)

不同水平精氨酸-甘氨酸-谷氨酰胺对断奶仔猪空肠体外酶活及细胞增殖与凋亡的影响

蒋 义 贾 刚*黄 兰 吴彩梅 王康宁

(四川农业大学动物营养研究所，雅安 625014)

本试验旨在研究精氨酸-甘氨酸-谷氨酰胺(A rg-Gly-Gln)对断奶仔猪空肠体外酶活及细胞增殖与凋亡的影响。试验采用单因子设计，设6个处理，培养液分别添加Arg-Gly-Gln 0、0.28、0.56、1.11、2.23、4.45 mmol/L，每个处理8 个重复，每个重复 1 个空肠组织块。检测培养液中乳酸脱氢酶(LDH)活力、肠组织中谷氨酰胺酶和二胺氧化酶(DAO)活力以及5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrDU)、半胱氨酸的天冬氨酸特异性蛋白水解酶-3(Caspase-3)阳性细胞百分比的变化。结果表明:1)与无添加的培养液相比，除添加0.56、2.23 mmol/L Arg-Gly-Gln在6 h时以及添加1.11 mmol/L Arg-Gly-Gln在24 h时无显著差异(P＞0.05)外，其余各时间点、各添加A rg-Gly-Gln的培养液中LDH活力均显著(P＜0.05)或极显著(P＜0.01)降低;2)与无添加的培养液相比，培养液添加1.11、2.23、4.45 mmol/L A rg-Gly-Gln空肠组织谷氨酰胺酶活力分别提高了 27.69%、46.15%、83.08%(P＜0.01)，培养液添加 2.23、4.45 mmol/L Arg-Gly-Gln 空肠组织DAO活力分别提高了66.34%和110.89%(P＜0.01);3)随着培养液A rg-Gly-Gln水平的提高，BrdU阳性细胞百分比增加，Caspase-3阳性细胞百分比降低。结果提示:Arg-Gly-Gln能够缓解细胞损伤并降低细胞膜通透性，提高空肠组织谷氨酰胺酶和DAO的活力，增强肠细胞对Gln的利用;Arg-Gly-Gln能够促进断奶仔猪离体空肠细胞增殖，抑制由Caspase-3介导的细胞凋亡，从而提高肠道黏膜的屏障功能。

精氨酸-甘氨酸-谷氨酰胺;断奶仔猪;空肠;细胞增殖;细胞凋亡

随着小肽营养研究的深入，人们逐渐认识到含谷氨酰胺(Gln)的小肽可能比Gln具有更强的营养生理功能。含Gln的小肽不仅吸收转运速度快、稳定性好，还能够改善肠道形态学结构，提高消化酶的活力［1］，促进肠细胞的增殖［2］，并缓解肠上皮细胞凋亡［3］。但这些研究主要针对含Gln的二肽［如精氨酸-谷氨酰胺(Arg-Gln)、甘氨酸-谷氨酰胺(Gly-Gln)］，Gln三肽是否也具有相同的肠营养效应，尚缺乏相关报道。不同结构的小肽与刷状缘细胞膜小肽载体的亲合能力有很大差异［4］，这可能会影响不同Gln小肽的吸收利用方式和速度，从而导致营养生理功能出现差异。Huang等［5］研究表明，精氨酸 -甘氨酸 -谷氨酰胺(Arg-Gly-Gln)不仅能以完整三肽的形式被肠道吸收，其吸收速率及比率还显著高于Gly-Gln、游离甘氨酸(Gly)和Gln，但其吸收后是否能够影响肠组织相关酶活(或功能)以及肠黏膜上皮细胞增殖、凋亡，目前还尚不清楚。因此，本试验以离体培养断奶仔猪空肠组织为模型，研究Arg-Gly-Gln对断奶仔猪肠道代谢相关酶活以及对5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrDU)、半胱氨酸的天冬氨酸特异性蛋白水解酶-3(Caspase-3)阳性细胞比的影响。在了解Arg-Gly-Gln对肠组织相关酶活以及细胞增殖、凋亡影响基础上，完善和丰富Gln小肽的肠营养生理效应研究，并为开发Gln小肽产品提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验时间、地点

2010年3月至2010年7月在四川农业大学动物营养研究所教育部抗病营养重点实验室进行。

1.2 试验材料

28日龄断奶的PIC健康仔猪离体空肠;Arg-Gly-Gln(纯度≥98%，杭州中肽生化);DMEM培养液(含L-谷氨酰胺 365 mg/L、甘氨酸18.75 mg/L、L-精氨酸盐酸盐 147.5 mg/L，美国Sigma)、BrdU、BrdU 抗体、Caspase-3 抗体、SABC试剂盒和二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司);乳酸脱氢酶(LDH)、谷氨酰胺酶、二胺氧化酶(DAO)试剂盒(南京建成生物试剂有限公司)。

1.3 试验仪器

常规手术器械、pH计、24孔培养板、全波长酶标仪(美国Thermo Fisher Scientific)、紫外分光光度计(上海美谱达公司)、二氧化碳培养箱(德国Heraeus)、组织切片机(德国 Leica)、倒置显微镜(德国Carl Zeiss)。

1.4 试验方法

1.4.1 试验设计

试验采用单因子设计，按Arg-Gly-Gln的浓度不同，设6个处理，Arg-Gly-Gln浓度分别为0、0.28、0.56、1.11、2.23、4.45 mmol/L。每个处理8个重复，每个重复1个肠组织块，每2个重复1个培养孔。用于测定酶活和研究细胞增殖的组织培养48 h，用于研究细胞凋亡的组织培养96 h。

1.4.2 肠组织块的制备

无菌条件下，将空肠剪成10 cm左右的肠段，用含200 U/m L青霉素、200μg/m L链霉素的PBS液漂洗后，将肠段切割成5 mm×5 mm的组织块，置于含100 U/m L青霉素、100μg/m L链霉素和10%胎牛血清的无菌DMEM培养液中进行培养。

1.4.3 培养、取样及样品处理

取各处理培养液1.5 m L加入24孔培养板中，置于37℃恒温培养箱中预热30 m in，然后将肠组织随机分配到培养液中，将培养板放在二氧化碳培养箱(37℃、5%CO2)中培养，每24 h换培养液1次。用于增殖试验的组织在培养24 h后，用含100μmol/L BrdU的培养液再培养24 h;其余组织一直用不含BrdU的培养液进行培养。

培养至 6、24、48、72、96 h，取少量培养液即刻分析LDH活力;96 h培养结束后，将用于检测活力的组织放入液氮中保存12 h，然后取出并置于-70℃保存待测;将用于研究细胞增殖和凋亡的组织用4%多聚甲醛磷酸缓冲液(pH 7.4)固定，保存。

1.4.4 测定指标和方法

LDH酶、谷氨酰胺酶和DAO的活力测定参照试剂盒说明书。LDH活力单位定义:1 000 m L培养液在37℃与基质作用15 m in，在反应体系中每产生1μmol丙酮酸为1个酶活力单位;谷氨酰胺酶活力单位定义:37℃、pH 8.6时，每分钟内转化1μmol Gln至Glu所需的酶量为1个酶活力单位;DAO活力单位定义:37℃、pH 7.2时，每分钟内氧化1μmol腐胺所需的酶量为1个酶活力单位。

BrdU和Caspase-3阳性细胞百分比采用免疫组织化学染色，参照邱曙东等［6］的方法进行。每个处理随机选取3张切片，每张切片随机选3～4个区域拍照，用Image-Pro Plus 6.0形态分析软件对阳性细胞进行分析，测定单位面积阳性细胞百分比。

1.5 数据处理

试验结果以平均值±标准差表示。采用SPSS 13.0对试验数据进行相关性分析和单因素方差分析，结合Duncan氏法进行多重比较，检验处理间的差异显著性。

2 结果

2.1 Arg-G ly-G ln对组织培养液中LDH活力的影响

由表1可知，组织培养液LDH活力的变化如下:6～24 h时逐渐升高，24 h时达到最高;24～72 h时逐渐降低，72 h达到最低;72～96 h时又有所增加。与无添加相比，除培养液添加0.56、2.23 mmol/L Arg-Gly-Gln在6 h时无显著差异(P＞0.05)以及添加 1.11 mmol/L Arg-Gly-Gln在24 h时无显著差异(P＞0.05)外，其余各时间点、各添加A rg-Gly-Gln的组织培养液中LDH活力均显著(P＜0.05)或极显著(P＜0.01)降低。

表1 A rg-G ly-G ln对空肠组织培养液LDH活力的影响Table 1 Effect of Arg-Gly-Gln on the LDH activity of jejunum tissue in culturemedium

2.2 Arg-G ly-G ln对谷氨酰胺酶和DAO活力的影响

由表2可知，与无添加相比，培养液添加0.28、0.56 mmol/L A rg-Gly-Gln 谷氨酰胺酶活力无显著差异(P＞0.05)，培养液添加 1.11、2.23、4.45 mmol/L A rg-Gly-Gln谷氨酰胺活力分别提高了 27.69%、46.15% 、83.08%(P＜ 0.01)。与无添加 相 比，培 养 液 添 加 0.28、0.56 mmol/L Arg-Gly-Gln DAO活力无显著差异(P＞0.05);添加量为1.11 mmol/L时DAO活力显著高于添加量为0.28 mmol/L 时(P＜0.05)，但与添加量为0和0.56 mmol/L时相比无显著差异(P＞0.05);与无添加相比，A rg-Gly-Gln添加量为 2.23、4.45 mmol/L时DAO活力分别提高了66.34%和110.89%(P＜0.01)。

2.3 BrdU免疫组化分析

培养48 h后，通过免疫组织化学法分析空肠组织中BrdU掺入细胞核的情况，发现BrdU免疫阳性产物呈黄色，各组均有分布，主要定位于细胞核(图1)。

图1 BrdU免疫组化染色阳性细胞Fig.1 BrdU-positive cells stained by immunohistochem isty(400 × )

随着培养液添加Arg-Gly-Gln水平的增加，BrdU阳性细胞百分比逐渐增加，4.45 mmol/L时达到最高(表3)。与无添加相比，添加量为0.56 mmol/L时差异显著(P＜0.05)，添加量高于1.11 mmol/L 后差异极显著(P＜0.01)(表 3)。相关分析结果表明，培养液中Arg-Gly-Gln的浓度与BrdU阳性细胞百分比之间存在极显著的相关关系(P＜0.01)。

表3 Arg-G ly-G ln对空肠组织BrdU阳性细胞百分比的影响Table 3 Effect of Arg-Gly-Gln on the percentage of BrdU-positive cells in jejunum tissue %

2.4 Caspase-3免疫组化分析

通过免疫组织化学方法定性和半定量了细胞中Caspase-3的表达情况。结果发现，在培养96 h后，Caspase-3免疫阳性反应产物在各处理细胞中广泛分布，主要定位于细胞浆中(图2)。

随着培养液添加Arg-Gly-Gln水平增加，Caspase-3阳性细胞百分比降低，但添加量为0.56和1.11 mmol/L 之间、2.23 和4.45 mmol/L之间均无显著差异(P＞0.05)(表4)。相关分析结果表明，培养液中Arg-Gly-Gln水平与Caspase-3阳性细胞百分比之间存在极显著的相关关系(P＜0.01)。

3 讨论

3.1 Arg-G ly-G ln对空肠组织细胞通透性的影响

LDH是存在于细胞浆内参与糖酵解最后一步即丙酮酸和乳酸相互转化的一种催化酶［7］。进行离体细胞培养时，如果细胞受损，LDH会由细胞漏至培养液中。检测离体培养液中LDH，可以客观衡量细胞的受损程度［8］。本试验中，6 h时各Arg-Gly-Gln添加组的LDH活力较高，可能是肠组织块制作过程中黏膜损伤导致的;6～24 h各Arg-Gly-Gln添加组LDH活力升高，可能是细胞损伤使LDH持续释放到培养液的结果;24 h后，各Arg-Gly-Gln添加组的LDH活力下降，肠组织细胞自我修复使受损程度降低。随着Arg-Gly-Gln水平升高各时间点的LDH活力降低，表明Arg-Gly-Gln可能降低了肠组织细胞细胞膜的通透性并缓解了细胞的损伤程度。

图2 Caspase-3免疫组化染色阳性细胞Fig.2 Caspase-3 positive cells stained by immunohistochem isty(400 × )

表4 Arg-G ly-G ln对空肠组织Caspase-3阳性细胞百分比的影响Table 4 Effect of A rg-Gly-Gln on the percentage of Caspase-3-positive cells in jejunum tissue %

3.2 Arg-G ly-G ln对空肠组织代谢相关酶活力的影响

Gln是动物血浆中含量最高的氨基酸，其在肠道黏膜上皮细胞代谢，不仅为肠黏膜细胞提供能源，并且为肝脏的糖原异生、尿素合成提供底物。Gln在肠黏膜上皮细胞的代谢主要靠线粒体内膜上的磷依赖性谷氨酰胺酶的分解作用［9］，调节该活力即可调节 Gln的代谢［10］。谢建新等［11］发现，全肠外营养供给的Gln能够显著增强大鼠小肠黏膜谷氨酰胺酶活力，从而促进小肠黏膜细胞对Gln的代谢和多胺的生成，发挥其促进小肠黏膜细胞分裂增殖以及防止小肠黏膜的萎缩的作用。Satoh等［12］发现Ala-Gln使小鼠术后谷氨酰胺酶活力及谷氨酰胺酶mRNA水平均显著升高，表明Gln小肽能够通过谷氨酰胺酶途径促进肠道适应。本试验 中，培 养 液 添 加 Arg-Gly-Gln 1.11～4.45 mmol/L后，谷氨酰胺酶活力显著提高，表明Arg-Gly-Gln可以通过提高谷氨酰胺活力增强空肠Gln的代 谢。这 与 Haque 等［13］、Tazuke 等［14］在Gln二肽上的研究结果一致。这可能是由于Arg-Gly-Gln在吸收转运过程中，受到位于刷状缘膜表面和细胞质内肽酶的水解，产生Gln和Gly-Gln等其他二肽和氨基酸在发挥作用，至于以完整形式被吸收转运的Arg-Gly-Gln是否发生了作用，有待进一步研究。

DAO是一种位于哺乳动物肠黏膜上层绒毛细胞胞浆中的细胞内酶［15］，在组胺和多胺代谢中起作用，也与肠黏膜细胞核酸和蛋白质合成密切相关，可以作为黏膜损伤后肠道细胞成熟度和完整性的标志酶［16］。DAO主要分布于肠道，以空肠和回肠活力最高［17-18］。肠黏膜细胞受损、坏死后该酶释放入血，或随坏死脱落的肠黏膜细胞进入肠腔内，导致血浆或肠腔DAO活力增高而肠黏膜内DAO活力降低。肠黏膜紧密排布的上皮细胞是肠道屏障功能的重要组成部分，因此血浆中或黏膜中DAO活力的变化可以反映肠道的屏障功能。Li等［19］研究发现，Gln可以显著降低创伤后大鼠血浆中的DAO活力并升高组织中的DAO活力，表明Gln能降低肠道的受损程度，促进肠道的修复过程，从而提高肠道的屏障功能。本试验中，Arg-Gly-Gln 添加量为 2.23、4.45 mmol/L 时，黏膜中DAO活力分别提高了66.34%、110.89%。这提示一定浓度的Arg-Gly-Gln也具有类似Gln的功能，能够起到改善肠道屏障功能的作用。

3.3 Arg-G ly-G ln对空肠组织细胞增殖和凋亡的影响

Gln是快速增殖细胞(如肠道细胞和免疫细胞)的重要“燃料”，可改善结肠炎大鼠的屏障功能［20］，防止断奶仔猪空肠绒毛萎缩，维持小肠黏膜的正常结构和功能［21］。BrdU是DNA前体胸腺嘧啶类似物，可通过竞争掺入细胞S期单链DNA核苷酸序列替代胸腺嘧啶，BrdU的掺入强度可反映细胞增殖的情况［22］。采用免疫组化染色法，结合图像分析进行评估BrdU阳性细胞百分比可以反映细胞增殖的情况情况［23］。本试验中，Arg-Gly-Gln可以促进断奶仔猪离体空肠上皮细胞增殖。这与 Scheppach 等［2］、Haynes等［3］在 Gln 和 A la-Gln上的研究结果相一致。

半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cysteinylasparate specific proteinase，Caspase)是一类与凋亡密切相关的蛋白酶家族。其中凋亡调控的主要执行者Caspase-3在细胞凋亡通路中具有重要作用。采用免疫组化染色法，结合图像分析进行评估Caspase-3阳性细胞百分比可以反映细胞的凋亡情况［24］。Erbil等［25］发现向大鼠饲喂 1 g/(kg·d)的Gln能够显著降低因辐射引起的Caspase-3增加，从而抑制肠上皮细胞的凋亡。在本试验中，随着Arg-Gly-Gln水平增加，Caspase-3活力下降。这表明Arg-Gly-Gln具有抑制细胞凋亡的作用，并存在剂量效应。Arg-Gly-Gln能抑制细胞凋亡，可能与Arg-Gly-Gln吸收转运过程中伴随着Gly-Gln和游离Gln的释放有关，Gly-Gln和游离Gln能促进隐窝细胞增殖、增强了损伤肠黏膜的修复，从而降低黏膜细胞的凋亡［26］。以完整形式转运的 Arg-Gly-Gln能否直接降低细胞凋亡，还有待进一步的验证。

通过上述研究，可以发现A rg-Gly-Gln能够显著影响空肠组织代谢相关酶的活力，并能够促进肠上皮细胞的增殖，抑制其凋亡。某种程度上讲，Arg-Gly-Gln执行了Gly-Gln和游离Gln的功能。但不能由此断定A rg-Gly-Gln的肠营养生理效应是完全通过Gly-Gln和游离Gln实现的。这是因为A rg-Gly-Gln还能够以完整三肽的形式被吸收。Arg-Gly-Gln发挥营养生理效应到底是完整的三肽形式，还是Gly-Gln和游离的Gln的形式，亦或者三者同时发挥效应，还有待进一步研究。Huang等［5］研究发现，初始浓度为 0.556 mmol/L、培养时间为40 m in时，Arg-Gly-Gln的吸收转运比率显著高于Gly-Gln和Gln。通过检测黏膜液、浆膜液以及组织当中的Arg-Gly-Gln、Gly-Gln和Gln含量发现，三肽组可以向动物机体提供的Gln的量＞二肽＞氨基酸。在不完全了解Arg-Gly-Gln发挥生理效应的形式时，以能提供的Gln的量来衡量其生理效应，可以推论:相同浓度的Arg-Gly-Gln的生理效应强于Gly-Gln和Gln。

另外，在Arg-Gly-Gln吸收转运过程中也伴随着Arg和A rg-Gly的产生。A rg也能够促进肠细胞增殖、抑制细胞程序性死亡［27］。原因在于Arg在肠道细胞经过一系列代谢生成鸟氨酸和多胺，多胺能够促进肠黏膜细胞的增殖和肠黏膜的发育;Arg还可以通过代谢途径转化为Gln发挥其生理功能。Arg-Gly-Gln能否通过Arg或者Arg-Gly来发挥作用，目前还有待进一步验证。

4 结论

①Arg-Gly-Gln能够缓解细胞损伤并降低细胞膜通透性，提高空肠组织谷氨酰胺酶和DAO的活力，增强肠细胞对Gln的利用。

②A rg-Gly-Gln可促进促进断奶仔猪离体空肠细胞增殖，抑制由Caspase-3介导的细胞凋亡，从而提高肠道黏膜的屏障功能。

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*Corresponding author，professor，E-mail:jiagang700510@163.com

(编辑 王智航)

Effect of Different Arg-G ly-G ln Levels on Jejunum Enzyme Activities，Cell Proliferation and Apoptosis of Weaned Pigletsin vitro

JIANG Yi JIA Gang*HUANG Lan WU Caimei WANG Kangning
(Animal Nutrition Institute，Sichuan Agricultural University，Ya’an625014，China)

This trialwas conducted to study the effect of Arg-Gly-Gln on jejunum enzyme activities，cell proliferation and apoptosis of weaned pigletsin vitro.A single-factor design was adopted and six treatmentswere set，which were supplementation of Arg-Gly-Gln at0，0.28，0.56，1.11，2.23 and 4.45 mmol/L in culture medium，respectively.Therewere eight replicates in each treatment and one jejunum tissue block in each replicate.The activity of lactate dehydrogenase(LDH)in culture medium，activities of glutam inase and diam ine oxidase(DAO)in intestinal tissues，percentages of BrdU-positive cells and Caspase-3-positive cells were determ ined.The results showed as follows:1)compared with that in culturemedium without supplemental Arg-Gly-Gln，LDH activity in culturemedium supplemented with Arg-Gly-Gln at different time point significantly decreased(P＜0.05 orP＜0.01)，excluding the culture medium supplemented with A rg-Gly-Gln at 0.56，2.23 mmol/L at6 h(P＞0.05)and 1.11 mmol/L at 24 h(P＞0.05);2)compared with that in culture medium without supplemental Arg-Gly-Gln，glutam inase activity of jejunum tissue in culture medium supplemented with Arg-Gly-Gln at 1.11，2.23 and 4.45 mmol/L increased by 27.69%，46.15%and 83.08%(P＜0.01)，respectively，and DAO activity of jejunum tissue in culturemedium supplemented with A rg-Gly-Gln at2.23 and 4.45 mmol/L increased by 66.34%and 110.89%(P＜0.01)，respectively;3)with the increasing of Arg-Gly-Gln levels in culture medium，percentage of BrdU-positive cells increased，but that of caspase-3-positive cells reduced.The results indicate that Arg-Gly-Gln can not only alleviate cell damage and reduce cellmembrane permeability butalso enhance the glutam inase and DAO activities，and promote the utilization of glutam ine by intestinal cells.In addition，Arg-Gly-Gln can promote the cell proliferation of jejunum and inhibit apoptosismediated by Caspase-3，resulting in the enhancement of barricade function of intestinal mucousmembrane.［Chinese Journal of Animal Nutrition，2011，23(9):1475-1482］

Arg-Gly-Gln;weaned piglet;jejunum;cell proliferation;cell apoptosis

S826

A

1006-267X(2011)09-1475-08

10.3969/j.issn.1006-267x.2011.09.004

2011-04-06

四川省杰出青年学术技术带头人资助计划(2010JQ0043);四川农业大学双支计划

蒋 义(1985—)，男，四川三台人，硕士研究生，从事饲料资源开发与高效利用研究。E-mail:570088434@qq.com

*通讯作者:贾 刚，教授，博士生导师，E-mail:jiagang700510@163.com