利用超高压诱变选育食品与发酵微生物的研究进展

王岁楼，王海翔

(中国药科大学食品科学与安全系，江苏 南京 210009)

利用超高压诱变选育食品与发酵微生物的研究进展

王岁楼，王海翔

(中国药科大学食品科学与安全系，江苏 南京 210009)

介绍超高压处理对食品与发酵微生物的诱变效应，包括其在酵母菌、细菌、霉菌等诱变选育中的应用实例，并对超高压诱变微生物的机理及影响因素进行探讨，最后指出超高压作为一种新的微生物诱变育种方法将会在食品与发酵工业领域具有广阔的应用前景。

超高压；微生物；诱变

高压、超高压(ultra high pressure，UHP)是一个相对的概念，一般认为100MPa以上的压力为超高压，也称为高静水压(high hydrostatic pressure，HHP)或静水高压[1]。通常认为，超高压对微生物的作用是破坏性的，因此在食品科学领域开展超高压灭菌的研究较多。虽然对食品进行高压处理具有低能量输入及保护小分子稳定性和最大限度保持食品原有生鲜风味与营养成分等优势，但由于成本较高及产业化困难，目前在国内外还多处于理论或实验室研究阶段[2]。

超高压不仅可使微生物细胞体积形态、细胞组分发生变化，还可使微生物的基因表达和核酸结构及其生物学功能发生改变[3]。由于一切生物的遗传物质基础都是核酸尤其是DNA，所以任何能改变核酸结构的因素都可能引起核酸生物学功能的改变，而凡是能引起核酸功能改变的因素，一般也能引起突变，这是“生物化学统一性”法则的一个具体例证。然而在过去由于技术和设备所限，一直缺乏实例支持，人们认为高压主要是物理过程引起的菌体细胞变化[4]，例如细胞形态变化、细胞膜壁破坏、细胞内显微结构变异等，很难直接发生在DNA基因水平上，一些在极端环境下生长的微生物的特殊基因是经过长时期(达几万年)的自然筛选才形成的[5]，因而认为高压诱变育种缺乏理论依据。但近年来已有研究表明，在高静水压作用下，大多数微生物不仅能够产生压力诱导蛋白质(PIPs)或自适应调整细胞膜蛋白的种类和含量[6-7]，而且遗传物质——核酸也有可能发生改变，如高静水压可导致啤酒酵母产生四倍体[8]，可使酵母和大肠杆菌的DNA含量大幅度减少[9]，这些都证明高静水压能影响DNA的复制，预示着高压育种技术的可行性。

1 超高压对微生物的诱变效应研究

国外方面，目前尚未发现开展超高压诱变微生物的研究，只有从海底深处筛选到了耐高压微生物的报道[5]。以微生物为处理对象的超高压研究国内外目前都有报道[10-11]，但一般以大肠杆菌和芽孢杆菌为处理对象，旨在研究食品超高压杀菌的可行性。王岁楼等[12-16]在2001年较早提出了把超高压用于发酵工业微生物诱变的设想，并先后对漆酶产生菌灵芝、鸡腿菇及产β-胡萝卜素红酵母等的高压诱变效应作了大量实验研究，获得了一些产量大幅度提高的可稳定遗传的超高压突变株。近几年来有关超高压诱变微生物的报道不断增多，例如刘凤珠等[17]发现高静压对啤酒酵母也有诱变作用；姜岷等[18]则在200MPa压力下筛选到了一株琥珀酸产量明显提高的放线杆菌突变株。

1.1 超高压在酵母诱变中的应用

王岁楼等[19]利用超高压对黏红酵母RG5进行处理时，获得的突变株RG5-3，其生物量虽然比出发菌株略有下降，但目的产物β-胡萝卜素的含量却提高了68.60%，传代实验表明该诱变株遗传稳定性良好，没有发生性状退化及回复突变。进一步利用限制性片段长度多态性(RFLP)分析比较发现，限制性内切酶HindⅢ和BamHⅠ切割的诱变株和出发株的DNA片段有着明显不同，初步证明了高静水压使黏红酵母在表面性状和DNA水平上都发生了改变。同时比较HPLC实验结果可知，菌株经超高压处理后不仅类胡萝卜素总量明显增产了，而且色素组成中β-胡萝卜素的比例也大幅度增加了，从原来的53.34%提高到81.44%，这是非常有意义的，因为一般认为黏红酵母β-胡萝卜素产量在其总类胡萝卜素中所占的比例偏低。

刘凤珠等[20]采用高静压处理，通过对实验室保藏啤酒酵母菌种SP-3进行诱变处理，发现在250MPa，保压时间为30min时，得到1株酵母菌株，酒精体积分数由原来的4.7%降低到3.1%，低于出发菌珠34%，凝聚性良好，双乙酰含量亦较低。王振伟等[21]分析了高压处理对啤酒酵母生长的影响，研究不同压力、不同保压时间对啤酒酵母致死率的影响，考察高压与啤酒酵母变异之间的关系。确定300MPa、保压时间为15min时，啤酒酵母具有较高的突变率，以此条件处理啤酒酵母，并以高温筛选，获得了耐高压耐高温变异菌株MS-3。

1.2 超高压在细菌诱变中的应用

高翔等[11]利用高压力处理大肠杆菌TG1、DH5α和HB101，得到了耐压的突变菌株TG1P、DH5αP和HB101P，其在220MPa高压力下的存活率提高了2～3个数量级，分别从1.06×10-6、2.98×10-4、3.65×10-3提高到8.31×10-3、3.4×10-1、1.69×10-1。通过双向电泳比较发现，TG1和DH5α两种菌株耐压突变菌的部分蛋白质组与原始菌的有所不同，有3个蛋白质的含量明显增加。经研究，其中1种蛋白质分子质量为21kD，其N端序列为V(L)EAGEFFMRA，与大肠杆菌中的1种外膜蛋白一致。

姜岷等[18]采用超高静压对一株产琥珀酸放线杆菌A3进行诱变育种，进一步提高其生产性能。在压力为200MPa、变压速度50MPa/min的诱变条件下对稳定期菌株进行诱变，筛选到一株突变菌株产琥珀酸放线杆菌B19，琥珀酸产量达到32.2g/L，比出发菌株A3提高了17.9%，代谢副产物乙酸的产量降低了11.5%，经过6次传代表明突变菌株具有稳定的遗传特性。

最近有人研究了高静水压处理对葡糖醋杆菌J2的致死率、形态、生化特征、产细菌纤维素能力及菌体生长速率的影响[22]，结果发现高静水压对菌株J2的作用效果显著。处理时间在30min内，菌株J2的致死率随着处理时间的延长而增大，30min时全部死亡；处理压力在300MPa内，菌株J2的致死率随着压力的增大而增大，300Pa时全部死亡。高静水压处理后菌株J2的形态发生了一定程度的变化，生化特性没有发生明显变化，但菌株对某些碳源和氮源的利用程度有明显差异。高静水压处理后的菌株发酵生产细菌纤维素的能力明显提高，且菌株的生长速度明显加快。

1.3 超高压在霉菌诱变中的应用

王华等[23]在压力100～400MPa、保压20min的条件下处理酱油酿造菌种——米曲霉，研究高压对米曲霉存活率、形态特征、生理性质、蛋白酶、淀粉酶活性等的影响，并诱变筛选优良菌株。结果表明：高压对米曲霉的存活率、形态特征有明显的影响；压力对蛋白酶及淀粉酶活性的影响也有特异的规律，即在一定压力范围内(0.1～200MPa)，蛋白酶的活性随着压力的增加而减小，但随着压力的进一步升高(200～400MPa)，蛋白酶的活性又逐渐增强，在300MPa时超过对照组，400MPa时蛋白酶的活性达到最高值；淀粉酶在0.1～100MPa时活性下降，在200MPa时其平均的糊化和糖化活性最强、活力最高，当压力升高活性又开始降低，400MPa时几乎又回到对照值。另外，高压处理后获得一株理想的变异菌株HP300a，其生长速度快、孢子数量多、蛋白酶活力高，且不易被杂菌污染。其成曲的几项主要指标均优于对照株，酿出酱油的几项主要指标也明显优于对照株。

1.4 超高压在其他微生物诱变中的应用

王岁楼等[12]对漆酶产生菌灵芝和鸡腿菇分别进行超高压处理，发现致死率随剂量的增加而增加，在致死率为50%～80%的范围内诱变效果较好。实验获得了两株具有较大应用潜力的超高压诱变菌——灵芝高压突变株G1502和鸡腿菇高压突变株C2003，其中G1502酶活比出发菌株提高了2.83倍，发酵时间缩短了1d；C2003酶活比原菌株提高了2.57倍，发酵时间也缩短了1d。

综上所述，高压能诱导酵母菌、细菌、霉菌等的突变，通过压力对菌株致死率的研究发现：一般在250～300MPa的压力下，菌株具有较高的突变率。获得的突变株性能明显优于出发株，且遗传稳定性良好。这些研究成果给超高压在菌种诱变上的应用提供了实证，表明了超高压在菌种诱变应用上的可行性。

2 超高压对微生物的诱变机理研究

2.1 超高压诱变的理论基础

超高压诱变具有其生物化学基础[3]，但目前有关微生物超高压诱变的研究，一般都是从实用出发，研究内容多限于利用超高压处理提高目标产物的产量，未能从DNA分子水平上进行变异检测的研究。高压法微生物育种，是一个全新的命题，若能成功，则有很突出的学术意义和应用价值，将在国内外遗传学界、微生物学界、发酵与生物化工领域引起相当的影响，甚至涉及更广的领域。微生物在高压生态条件下可以生存，这早已发现，但高压条件引起微生物的遗传突变，却是近几年来才有所报道。从科学的态度出发，目前既不能排除高压引起微生物遗传突变的可能性，但也不能过于匆忙做出高压能促进微生物变异的结论。也就是说，这些变异的出现究竟是因为在高压作用下，微生物遗传物质发生变化导致突变株产生，还是高压诱导某些基因的表达使其性状出现变化？甚至有可能在群体中本来就已经存在耐高压且高产的个体，高压处理只是起到了一种筛选的作用？因此，必须从分子水平尤其是从DNA分子水平上揭示超高压的诱变效应，探讨其诱导微生物变异的机理，才能为微生物超高压诱变育种提供理论支持，并使其成为一种可操作的技术加以普遍推广。

2.2 从基因水平上解释诱变效应

李芝莲[24]对高压诱导的啤酒酵母突变株和对照株进行PARD和ISSR分析，结果显示对照菌株及变异菌株在RAPD和ISSR的检测中多态性明显，分别为84.78%和67.27%。RAPD检测中对照菌株与变异菌株的平均绝对距离系数为0.720，ISSR检测中对照菌株与变异菌株的平均绝对距离系数为0.583。结果表明：高压能引起啤酒酵母产生可以稳定遗传生理上的明显变异，且这种变异是基于DNA分子水平的变异。李党生等[25]对高压诱导的啤酒酵母突变株和出发株进行了PARD分析，结果证实突变株经过诱变后得到的突变株基因组碱基序列发生了改变。

王华等[23]对高压诱导的米曲霉突变株和对照株进行了PARD和ISSR分析，结果发现，两种标记都能揭示材料间较高的多态性，其中RAPD标记多态性又高于ISSR标记，分别为84.44%和73.22%。RAPD检测中对照菌株与变异菌株的平均绝对距离系数0.750，ISSR检测中对照菌株与变异菌株的平均绝对距离系数0.553。研究结果表明高压诱导的突变株DNA分子产生了变异。

上述研究结果表明高压致突菌株与出发菌株的DNA分子产生了差异，从基因水平上阐述了变异的原因。但未对如何造成这种差异作出解释，这也为进一步深入探讨超高压诱变的机理带来了困难。笔者认为可以从下面几点来进一步深入开展工作：1)对部分RAPD产生的特异片段克隆测序和DNA序列分析，利用软件分析和数据库检索，对特异片段DNA进行同源性分析，判断DNA哪些位点在高压的作用下发生了变化；2)对菌株的关键蛋白进行分析，找出差异蛋白；3)对依赖于DNA的RNA聚合酶变异进行分析；4)对DNA位点的改变与性状改变之间建立相关性分析。

3 超高压诱变的优势及影响因素

3.1 超高压诱变的优势

虽然采用基因工程和代谢工程技术定向改进菌种是发展的方向，但由于该类技术本身的特点及操作复杂、条件要求苛刻、成本过高等原因，一般多停留在实验室水平或学术研究层面，如基因工程技术目前主要还只是应用在酶和蛋白质类产物(药物)的开发研究方面，而对生产其他代谢产物的微生物菌种进行改良的行之有效的方法仍然是诱变育种。可以说，目前具有重要工业生产价值的微生物基本上还都是人工诱变株，如利用紫外线、X-射线、γ-射线和亚硝基胍、硫酸二乙酯等对菌种进行诱变处理，往往会获得产量大幅度提高的突变株。但另一方面，这些诱变源一般都有毒性或辐射污染，而且由于反复使用导致其诱导新突变的能力减弱及菌种性能容易退化。此外，近年来开始采用的离子注入、航天搭载诱变等技术，也存在成本较高、装备复杂、操作不便或不易随时实现等诸多缺点。

超高压处理作为当今高新技术之一目前已被用于食品杀菌和保鲜加工，但由于成本高和产业化困难，目前在国内外还多处于理论或实验室研究阶段，真正进入市场的高压食品还很鲜见。然而从前述可知，利用超高压技术选育出微生物高产突变体已有实例，并且王岁楼等[14]相关研究表明，与传统诱变育种方法相比，超高压诱变具有高效、操作简便、无污染、无毒害、周期短、突变率和正变率较高等特点，可能更具应用和推广价值。

3.2 影响超高压诱变的因素

影响微生物高静水压诱变的因素非常多、也非常复杂[3,26-32]，如压力、温度、作用时间、水环境、培养基成分、p H值、菌龄、升压和卸压速度等。

首先是压力。在高静水压作用下，微生物细胞的受压环境相当重要，其中压力的影响至为关键。在较低压力条件下，细胞仅仅是被迫激活膜物质合成基因以克服细胞膜结构受到的影响；而较高的压力还诱导一些未知的基因和酶产生，这些诱导物主要消除高压力所造成的更为不利的影响，如降解变性蛋白质等。因此，在一定程度上，可以认为高静水压的生物效应就是微生物细胞对自身在该条件下的修复响应。

其次为温度。在研究高静水压对微生物的影响时，必须将其纳入压力-温度体系进行考察研究。压力和温度这两个重要的物理参数，在某些热力学特性上非常相似。因此，当对压力影响机制不太了解的情况下，可让压力套用温度模型，再反过来验证修改压力模型。

再次为水环境。微生物细胞必须在水环境中才能均匀地受到压力作用，但水不只是充当介质和保护作用。水分子在压力下可以渗透到天然蛋白质分子内部并改变蛋白质的构象，使其折叠或展开，从而失去原来特有的三级结构，成为一种特殊的中间态。这种构象在压力诱导解链变性的Arc阻遏子中已得到了证实[26]。

4 结 语

超高压的生物效应已被人们所认识和利用，但目前主要是利用其致死效应将超高压用于食品杀菌和加工等领域，而对其诱变效应尚未足够重视和利用。由于高压作用于微生物细胞，不只作用于细胞壁、细胞膜、蛋白质等，还作用于核酸，所以高压很有可能影响微生物DNA的复制并引起微生物的突变。目前已有研究表明超高压能诱导微生物的突变，并且获得了性状优良、遗传稳定性良好的突变株。虽然人们在实践中已经得到了突变株，但仍然需要从理论上阐述高压诱变微生物的机理，现在的研究主要发现了突变株与出发株DNA分子上的差异，但高压如何造成这种差异还需要进一步研究。可以相信，随着高压生物科学与技术的不断发展及对高压诱变机理与影响因素的深入研究，超高压作为一种新的微生物诱变育种方法，一定会在食品发酵领域具有广阔的应用前景。

[1]陈复生. 食品超高压加工技术[M]. 北京: 化学工业出版社, 2005: 1-2.

[2]祝恒信. 超高压技术在食品工业中的研究与应用[J]. 河北农业技术师范学院学报, 1995, 9(3): 69-73.

[3]王岁楼, 吴晓宗, 郝莉花. (超)高压对微生物的影响及其诱变效应探讨[J]. 微生物学报, 2005, 45(6): 970-973.

[4]李勇. 高压致死微生物的研究进展[J]. 微生物学通报, 1995, 22(4): 243-245.

[5]KATO C, INOUE A, HORIKOSHI K. Isolation and characterizing deep sea marine microorganisms[J]. Trens Biotechnol, 1996, 14(1): 6-12.

[6]van BOGELEN R A, NEIDHARDT F C. Ribosome as sensors of heat and cold shock in Escherichia coli[J]. Proc Natl Acad Sci, 1990, 87(15): 5589-5593.

[7]CHI E, BARTLET D H. Use of a reporter gene to follow high pressure signal transduction in the deep sea bacterium Photo bacterium SS9[J]. Bacteriol, 1993, 175(23): 7533-7540.

[8]BARTLETT D H, KATO C, HORIKOSHI K. High pressure influences on gene and protein expression[J]. Res Microbiol, 1995, 146(8): 697-706.

[9]ABE F, HORIKOSHI K. Tryptophan permeates gene TAT2 confers high-pressure growth in Saccharomyces cerevisiae[J]. Mol Cell Biol, 2000, 20(21): 8093-8102.

[10]HAUBEN K J A, BARTLETT D H, SOONTJENS C C F. Escherichia coli mutants resistant to inactivation by high hydrostatic pressure[J]. Appl Environ Microbiol, 1997, 63(3): 945-950.

[11]高翔, 李炯, 阮康成. 高压力诱变的耐压大肠杆菌[J]. 生物化学与生物物理学报, 2001, 33(1): 77-81.

[12]王岁楼, 孙君社, 王琼波. 超高压对漆酶产生菌的诱变效应研究[J].工业微生物, 2006, 36(2): 31-35.

[13]王岁楼, 孙君社, 王琼波. 超高压对灵芝生长及其漆酶合成的影响[J]. 生物技术, 2006, 16(4): 52-54.

[14]王岁楼, 王琼波, 孙君社. 紫外和超高压诱导漆酶产生菌变异的对比研究[J]. 郑州轻工业学院学报, 2005, 20(3): 39-42.

[15]WANG Suilou, SUN Junshe, HAN Beizhong. Optimization of βcarotene production by Rhodotorula glutinis using high hydrostatic pressure and response surface methodology[J]. Journal of Food Science, 2007, 72(8): 325-329.

[16]WANG Suilou, CHEN Dejing, DENG Baiwan. Effects of high hydrostatic pressure on the growth and itsβ-carotene production of Rhodotorula glutinis[J]. Yeast, 2008, 25(4): 251-257.

[17]刘凤珠, 张辉, 穆凯峰. 高静压对啤酒酵母诱变效应的研究[J]. 酿酒科技, 2008(3): 51-55.

[18]姜岷, 陈可泉, 蔡婷. 超高静压在琥珀酸生产菌株选育中的应用[J].微生物学通报, 2008, 35(4): 561-564.

[19]王岁楼, 韩北忠, 孙君社, 等. 利用高静水压技术提高黏红酵母生物合成β-胡萝卜素的产量[J]. 现代化工, 2007, 27(5): 38-41.

[20]刘凤珠, 张辉, 穆凯峰. 高静压对啤酒酵母诱变效应的研究[J]. 酿酒科技, 2008(3): 51-55.

[21]王振伟, 王恺. 高压诱变啤酒酵母及突变株SDS-PAGE电泳分析[J].科技咨询, 2009(25): 7.

[22]毋锐琴, 李志西, 邵东燕. 高产细菌纤维素菌株的选育及初步鉴定[J]. 中国酿造, 2008(10): 37-38.

[23]王华, 申斯乐, 李志慧. 高压对米曲霉理化性质影响及诱变的研究[J]. 高压物理学报, 2008, 22(3): 259-264.

[24]李芝莲. 高压对啤酒酵母理化性质影响及诱变的研究[D]. 长春: 吉林大学, 2008.

[25]李党生, 王振伟. 高压诱变啤酒酵母研究及其突变株RAPD分析[J].食品科学, 2009, 30(21): 225-228.

[26]BARTLETT D H. Pressure effects on in vivo microbial processes[J]. Biochemical et Biophysical Acta, 2002, 1595(1/2): 367-381.

[27]PASCALE M, GASTON H B H. Effects of high hydrostatic pressures on living cells: a consequence of the properties of macromolecules and macromolecule-associated water[J]. Int Review of Cytology, 2001, 201: 1-84.

[28]GAO Yulong, JIANG Hanhu. Optimization of process conditions to inactivate Bacillus subtilis by high hydrostatic pressure and mild heat using response surface methodology[J]. Biochemical Engineering Journal, 2005, 24 (1): 43-48.

[29]RIKIMARU H. High pressure in bioscience and biotechnology: pure science encompassed in pursuit of value[J]. Biochimica et Biophysica Acta, 2002, 1595(16): 397-399.

[30]BOONCHAI B, BOONYARATANAKORNKIT T. Pressure effects on intra and intermolecular interations within proteins[J]. Biochimica et Biophysica Acta, 2002, 1595(16): 235-249.

[31]CLAUDE B Y, CHENG Ruankang. An emerging field in bioscience: High hydrostatic pressure study[J]. Acta Biochimica et Biophysica Sinica, 1999, 31(6): 619-624.

[32]PILAR M, BERNARD M. Morphological and physiological changes induced by high hydrostatic pressure in exponential-and stationaryphase cells of Escherichia coli: relationship with cell death[J]. Appl Envir Microbiol, 2004, 70(1): 1545-1554.

Research Progress of Microbial Breeding Induced by Ultra High Pressure for Food and Fermentation Industries

WANG Sui-lou，WANG Hai-xiang
(Department of Food Science and Safety, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009, China)

This paper has introduced mutation examples of microorganisms induced by ultra high pressure (UHP), such as the mutation of yeasts, bacilli, moulds and epiphytes. The mutation mechanisms and factors for affecting microorganisms have also discussed. Finally, UHP technology as a useful method to improve breeding in food and fermentation industry in the future has also proposed.

ultra high pressure；microorganism；mutation

TS261.15

A

1002-6630(2011)03-0277-04

2011-01-10

国家自然科学基金项目(31071590)

王岁楼(1961—)，男，教授，博士，研究方向为食品生物技术与食品安全。E-mail：cpuwsl@126.com