家兔精液品质评定方法的研究进展

郑 洁，谢晓红，易 军，雷 岷，任永军，张翔宇

（四川省畜牧科学研究院，四川 成都 610066）

人工授精应用到家兔生产中已经有20多年的历史，该方法比传统的自然交配更能集中分娩，在生产管理上更具有计划性。由于家兔精子的质量直接关系到精子的活力和受胎率，能否客观地评价精子质量和活力是人工授精和体外受精技术的关键，因此如何评定精子质量成为了人们关心的话题。本文将对家兔精液质量评定的方法和研究进展进行阐述。

1 家兔精液量、精子密度和形态

家兔精液量采用微量移液器直接测定。精子密度可采用血细胞计数板在光学显微镜下直接计数。精液形态可采用光学显微镜直接观察记录。这些方法带有一定的人为误差，但操作简单易行，不需要昂贵的仪器，特别适合临床和现场使用，属于常规检测方法。目前多运用流式细胞仪和计算机辅助精子分析仪（CASA）来分析精子的密度和运动形态。流式细胞仪通过测量精子及其他颗粒的散射光来快速分析颗粒的物理和化学性质，并对细胞进行分类收集，可以高速分析大量的精子，但该方法耗资较高，限制了其在生产上的应用。CASA是在光学技术的基础上结合计算机图像识别、运动图像处理技术发展起来的精子运动能力的综合分析方法。这种方法不仅提高了检测结果的客观性和快速性，还引入直线运动速度（VSL），曲线运动速度（VCL）、平均路径速度（VAP）、运动的前向性（STR）、直线性（LIN）、摆动性（WOB）和鞭打频率（BCF）等传统检测方法不能提供的参数。准确的CASA分析结果能预测精子的受精能力和人工授精的受胎率。但是CASA分析样品的准确性受到诸多因素的影响，如精子浓度、样品中细胞的成分、非细胞颗粒的干扰、测量中精液的流速和精子计数池的型号等。自动、快速分析精子质量是今后精子质量检测的重要发展方向，因此建立一种标准条件下的CASA分析方法是非常有必要的。

2 家兔精子运动力

运动力保证精子在受精过程中与卵子相遇，并完成对卵膜的机械穿透作用，通常是用精子活力来评价。精子活力是指有向前运动能力的精子数与总精子数的比例。通常正常运动的精子在普通光学显微镜下可直接观察记录，但是这种方法存在主观误差，因此精子活力并不是评定精子潜在受精能力的一个可靠指标。虽然精子活力并不能直接反映其受精能力，但是精子的正常运动是精子能够到达受精部位的基础。

现在，精子活力可采用CASA和精子质量分析仪（SQA）来分析。SQA是通过把精子运动所引起的光密度值（OD值）的变化转化为电信号，再把这类波样电信号转化为精子活动指数（SMI）来评定精子的运动状态的。SQA可以检测总精子密度、TFSC、正常形态精子百分率、SMI和精子活动率等指标。SMI值与精子的密度和运动精子的百分率等存在相关性，并且死精子不影响SMI值。据报道，SQA检测的SMI与CASA分析的向前运动的精子密度之间存在显著相关，说明用SQA分析精子运动性具有一定的可靠性。但是SQA不能同时分析精液中的红细胞和白细胞，也存在精液未稀释而影响检查结果的问题。

3 家兔精子活率

精子活率是指活精子数与总精子数的比率，在普通光学显微镜下检测，是检测精子质量的常规指标。家兔精子活率检测中常把观察到的运动精子作为活精子，以此来计算精子活率，10%呈直线运动的其活力为0.1，20%呈直线运动的其活力为0.2，以此类推，满分为1。这种方法受温度、液体黏稠度以及人为因素的影响，精子活率检测结果的主观性很强。目前检测家兔精子活率的方法有：常规染色法和荧光染色法。

常规染色方法有伊红、伊红-苯胺黑和中性红3种。伊红带有阴离子，能渗透到死精子内部与阳离子结合而呈红色，活精子因细胞膜完整而不能着色。中性红为水溶性染料，能通过活精子的细胞膜储存于细胞内，使其着色，而死精子不着色。最后，通过统计染色精子数来评价精子活率。但是在常规染色过程中，精子容易受到损伤而死亡，使其活率低于实际值。

荧光染色技术按其染色作用机理分为两类：一类是染色剂进入死亡精子的受损质膜内部使其着色。溴化乙锭（EB）、溴乙啶二聚体（EH）、碘化丙锭（PI）和Hoechst3258等都是死精子特异性的荧光探针。另一类是某些染色剂本身没有荧光性，却能进入活体精子细胞内部，在各种非特异性酯酶的作用下转化为呈现绿色荧光的荧光物质，这些产物不能通过完整的细胞质膜。羧基荧光素双醋酸盐（CFDA）、羧基二甲基荧光素双醋酸盐（CDMFDA）、钙黄素乙酰基甲基酯（CAM）、Hoechst33342和SYBR-14等都是活精子特异性的荧光探针。目前，实际检测中更倾向于两类荧光探针的联合使用。荧光染色技术是评价精子活率的一个有效方法，但是使用荧光染色技术需要配备荧光染色显微镜，该仪器较为昂贵，因此限制了该技术的应用。

4 家兔精子质膜完整性

精子质膜是精子最容易损伤的部位。功能完整的质膜是精子新陈代谢，完成获能、顶体反应以及与透明带（ZP）结合并穿过ZP的基础。因此精子质膜是否完整是区分精子状态的一个间接指标，同时也是精子能够发生顶体反应的基本条件。目前检测精子质膜的方法主要有3种：低渗肿胀试验法（HOST）、常规染色法和荧光探针染色法。

精子质膜能够有选择地运输水分子，当质膜完整的精子被放到低渗溶液中时，水会进入精子内部直至精子胞质内外环境达到平衡。由于水的内流，精子尾部的质膜就要向外周膨胀使精子体积增大、顶体肿胀、尾部弯曲，尤其以尾部弯曲这一特征比较明显。因此可以用弯尾率作为评价精子质膜完整性的指标。据报道，精子弯尾率与精子获能率、穿卵率和精子活力显著相关。此外，刘国世对狐精子进行了检测，发现狐精子的HOST与常规精液品质检测中的活力显著相关。HOST因具有简单、迅速和廉价的优点，目前已经被运用于对兔、马、狗、牛、羊、小鼠和人等精子质膜完整性的检测。

5 家兔精子顶体完整性

精子顶体是覆盖于精子核前2/3以上区域的囊状结构，囊的内外层分别是顶体内膜和顶体外膜。顶体内富含多种蛋白水解酶，即顶体酶，在精子穿过卵子放射冠和透明带等受精过程中，顶体酶发挥着重要作用。精子要穿过透明带必须有正常的顶体，顶体异常通常伴随顶体酶质和量的改变，故精子顶体完整性与精子功能相关。顶体存在与否常通过染色来判断。常用的染色方法有考马斯亮蓝染色法、孟加拉玫瑰红/固绿染色法、巴氏染色法和荧光染色法等。

考马斯亮蓝染色法是评价精子顶体完整性的一种简单方法，直接染色后就可以在普通光学显微镜下观察。目前评价兔精子的顶体状态常用该方法。荧光染色法主要有两类常规的荧光探针。一类是金霉素（CTC）以及一些与细胞外抗原结合的抗体。CTC顶体染色法可客观地对精子获能和顶体反应进行定量评价。另一类是外源植物凝集素及一些与精子内顶体抗原结合的抗体，其中的外源植物凝集素常被用来评价顶体的状态。检测中通常将异硫氰荧光素（FITC）与豌豆凝集素（PAS）、花生凝集素（PNA）、伴刀豆凝集素（ConA）结合使用。在牛和猪精子检测中，用FTIC-PNA检测顶体状态的结果与精子直线运动的精子数、HOST等方法检测的精子顶体状况高度相关，而且经电子显微镜证实，PNA能特异结合顶体外膜。现在该方法已经被用于评价马、猪、牛、羊和人精子的顶体状态。

6 家兔精子染色质状态

家兔精子核高度致密，其DNA与鱼精蛋白紧密结合，这样可以将父方遗传信息准确无误地导入卵子，继而传给后代，因此精子染色质结构的完整性对于精确传递遗传物质至关重要。检测精子染色质完整性常用的方法是PI染色和吖啶橙（AO）染色。

7 家兔线粒体活性

精子的运动能力与线粒体的活性密切相关，线粒体能持续提供精子运动所需的ATP能量，因此线粒体的活性是评价精子质量的一个关键指标。检测精子线粒体活性的荧光探针主要有Rhodamine123（R123）、MITO和JC-1等。R123可检测线粒体有无功能，但不能区别线粒体膜电位的高低。MITO在水溶液中并不产生荧光，而当积聚在线粒体内时，不论其膜电位如何都会产生绿色荧光。JC-1在线粒体膜电位较高时，可以产生红色荧光；在线粒体膜电位较低时，可以产生绿色荧光。这样可方便地通过荧光颜色的转变来检查线粒体膜电位的变化，利用红绿荧光的相对比例来衡量线粒体去极化的比例。这些探针常和精子活力探针结合使用。

8 家兔精子受精能力

通过检测精子的受精能力可以更准确地评价精子获能、顶体反应和核去致密化以及受精后胚胎的发育能力。透明带是体内受精的第一道屏障，在精子和卵子质膜融合并进入卵细胞前，精子必须粘附、结合并穿入透明带内。只有形态正常的精子才能与透明带结合，因此，精子与透明带的结合分析能够准确评价精子的受精能力，这是一种非常有应用前景的检测方法，但是该方法需要大量的新鲜卵母细胞，这对于大多数哺乳动物来说都比较困难。第二种方法是把透明带等份分割后，估计透明带外表面上结合的精子数目，目前已经被应用于对人、马和猪精子受精能力的分析中。第三种方法是利用溶解的透明带进行分析。此外，体外精子穿入透明带卵子的能力也常用于检测精子的受精能力，在同源卵子较难获得的情况下，该方法多采用去透明带异种卵子进行分析，目前已经用于检测大多数哺乳动物和人精子的受精能力，且与其受精能力显著相关。

9 结语与展望

体外检测精子的受精能力和功能状态的方法很多。简便检测的方法有精子精液量、密度、形态、活力、活率、常规染色和HOST，自动和快速检测的方法有CASA和SQA检测。科学准确的精液质量检测方法是家兔人工授精和体外受精成功与否的重要因素。随着精子质量检测技术的发展，只有将各种检测设备和探针综合运用，才能对精子质量、受精能力进行科学、准确、快速的评定，这也是本领域发展的一个必然趋势。

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