恶性血液病感染患者血清TLR4表达及临床意义

冯振军，赵春亭，李光耀

(1青岛大学医学院，山东青岛266003;2青岛大学医学院附属医院;3聊城市人民医院)

TOLL样受体(TLRs)是人体内天然免疫系统中的细胞跨膜受体，也是原模式的识别受体，TOLL样受体通过识别病原微生物的特殊结构来迅速激活天然免疫，诱导获得性免疫的产生［1，2］。其中 TLR4 在脓毒血症中的表达已有较多报道，多认为TLR4表达与脓毒血症的病原识别、抗炎免疫信号启动及转导等相关，同时介导了组织损害。2009年11月～2011年3月，我们检测了45例恶性血液病患者不同菌种感染后TOLL样受体4(TLR4)的表达，探讨TLR4对恶性血液病临床感染的诊断意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 45例恶性血液病感染患者(观察组，化疗后处于缓解期)男31例，女14例;年龄21～78岁。其中淋巴瘤18例，骨髓瘤27例。感染部位:肺部感染19例，肛周感染8例，肠道感染8例，口腔感染10例。恶性血液病均符合《血液病诊断与疗效标准》［3］;感染条件:有感染症状、体征，体温＞38℃超过2 h。血培养或分泌物(尿及大便)分离出病原微生物或血液中检测到病原体的抗原物质。观察组革兰阴性菌感染16例，革兰阳性菌感染9例，真菌感染4例。选取查体健康者5例(对照组)，两组一般资料有可比性。

1.2 血清TLR4检测 两组均取外周血，EDTA-K2抗凝，4℃冰箱保存待检。检测时均取100 μl标本加入到20 μl抗体组合为CD14-FITC/TLR4-PE的专用流式试管中。混匀，室温避光孵育20min。加2 ml溶血素，室温避光孵育10min，1 500 r/min离心5min，倒去上清，加入2 ml缓冲液洗涤，1 500 r/min离心5min，去上清，加入100 μl冲液。上流式细胞仪检测，以CD14及TLR-4抗体染色双阳性细胞百分率记录结果。

1.3 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。计量数据均以±s表达，两组均数比较用t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

对照组TLR-4阳性率为41.2% ±0.8%。不同致病菌感染者TLR-4的表达:革兰阴性菌、阳性菌及真菌感染者阳性率分别为 70.4% ±2.5%、41.2% ±1.3%、40.5% ±2.0%，革兰阴性菌感染者与对照组及其他菌种感染者比较，P均＜0.05。不同感染部位TLR-4的表达:肺部、肛周、肠道、口腔部位感染者TLR-4阳性率分别为62.2% ±11.3%、49.7% ±2.5%、50.1% ±2.9%、46.9% ±2.3%，以肺部感染者阳性率最高，与对照组相比，T=－4.081，P=0.001;而口腔、肛周与肠道感染者TLR-4水平无显著差异。革兰阴性菌感染者治疗前TLR4阳性率为70.4% ±2.5%，体温控制3、7 d后T分别为62.3% ± 3.3%、44.9% ± 1.5%，治疗前后比较，P 均 ＜0.01。

3 讨论

恶性血液病患者感染发生率高，确定致病微生物对指导临床治疗有重要意义。病原相关分子模式(PAMP)是病原对人体致病的重要分子结构，通常是一定类别病原微生物所共有的、高度保守的分子结构。研究证实，病原相关分子模式的特征:①为一定病原微生物所特有，区别于其他微生物结构;②为微生物在人体内生存和致病所必需;③为宿主泛特异性识别的分子基础。而在人体对PAMP识别的、分子结构为TOLL样受体(TLRs)，是一类固有免疫系统中跨膜受体，TOLL样受体主要在固有性免疫系统细胞表面表达，如单核细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞等。现有研究已经证实，TRL4在机体抵抗革兰阴性菌入侵的先天免疫中有重要作用。细菌内毒素/脂多糖(LPS)是革兰阴性菌的主要致病结构及分子基础。

LPS位于革兰阴性菌细胞壁的外层，包括三个部分，即O特异性链、核心多糖和类脂A。其毒性部分是类脂A，与细菌致病有关。LPS作用人体的生物学效应包括:①与机体组织结合直接导致细胞损伤，刺激单核-巨噬细胞系统等释放炎性介质、酶等;②作用于凝血、纤溶系统激发播散性凝血;③可激活补体和B细胞;④发热、休克、致耐药性和致死性等。研究认为，革兰阴性细菌在进行活体繁殖或崩解时可释放内毒素或LPS［6］，从而引起全身毒性反应。在机体内，LPS介导的免疫信号的激活需要血浆或细胞表面和内毒素结合的蛋白作为载体，而TRL4正是介导人体内LPS诱导免疫细胞激活的敏感受体。LPS通过一定途径进入人体后，首先进入血循环，与血浆的LPS结合蛋白(LBP)识别并结合，之后再结合于单核等介质细胞表面的CD14分子［7］。CD14通过 GPI锚定于单核细胞膜。LPS以LPS2-LBP2-CD14形式的三体复合物活化TLR4信号传导。结合于TLR4胞外区的MD22是一种可溶性蛋白分子，通过与TLR4结合来提高对LPS的敏感性，并可增加结构的稳定性。研究发现，TLR4基因缺失鼠分离的巨噬细胞和B细胞对LPS低敏，说明LPS信号转导需要TLR4的参与;转染人类TLR4基因的293细胞，可以被LPS2CD14呈剂量及时间依赖性活化，引起NF2κB及其控制的相关基因的激活和表达［8］。

根据以上作用模式，现代免疫学认为，TLR4是人体内LPS作用的优先受体，TLR4作为细胞膜上LPS的信号成分参与LPS的细胞激活，并可介导LPS对人体的免疫损伤。本研究发现，恶性血液病患者TLR4的基础水平与健康人并无区别，认为尽管此类患者存在免疫功能缺陷，临床上对感染易感，但在病原微生物的识别上与免疫功能正常的人群无显著差异，其免疫功能降低可能存在于免疫信号的转导或效应阶段。本研究亦发现，革兰阴性菌感染者TLR4阳性率明显升高，而在临床抗感染治疗好转后，其TLR4的表达又明显下降，说明TLR4的表达与革兰阴性菌感染密切相关。TLR4的检测对革兰阴性菌感染具有一定的判定意义。LPS对各种细胞TLR4表达的影响与作用时间和作用浓度有关，并有种系特异性和组织细胞特异性，作用机制可能比较复杂。但是可以看出LPS对TLR4表达的影响以上调为主。本研究革兰阴性菌感染者，TLR4的表达出现明显上调，属于机体对外界感染的防御性机制。

TLR4的表达和功能对机体的天然免疫系统和获得性免疫系统在感染的控制具有重要作用。TLR4表达的调节可能是一把双刃剑，一方面其在宿主抵御微生物入侵方面有重要作用，作为感受器在病原入侵时激发机体的免疫反应;另一方面其作为机体内源性毒性信号的受体，可进一步导致组织损害。本研究肺部感染患者TLR4阳性率显著升高，临床感染症状相对较重，抗感染效果较差，恢复时间较长，说明重症革兰阴性菌感染病例可能已经合并严重的内毒素血症，机体免疫调节功能出现紊乱，TLR4表达上调对其抗感染免疫起了负面作用。

综上所述，TLR4在恶性血液病革兰阴性菌感染，尤其是肺部感染时广泛表达，对临床诊断有一定参考价值。

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