蛋白质组学技术在鱼类安全生产中的应用研究进展

王 任 王彦波 冯立芳 李学鹏 李婷婷 励建荣

鱼类为世界上将近2/3的人提供了40%的蛋白质，目前全世界人类食用的鱼类中接近50%来源于水产养殖。水产养殖的鱼类总量在过去的50年里大幅度增长，从20世纪50年代不到1百万吨迅速增长到2006年的5.17亿吨[1]。但是，随着研究的深入，鱼类安全生产中的诸多问题特别是鱼类物种的分子鉴定、品质的动态变化以及鲜度的分子表征等仍需要新的技术手段来解决。蛋白质是几乎所有生物学过程的功能单位，而蛋白质组是指一个细胞在特定时间和特定环境条件下所有蛋白质的表达。随着蛋白质组学技术的发展，已成为研究包括鱼类在内的生物系统及其在不同条件下动态变化的有利工具，在解决有关鱼类生产问题上的研究也取得了显著成果[2]。蛋白质组学技术在硬骨鱼类安全生产中的应用研究清晰表明了环境对鱼肌肉的加工和品质的影响[3-5]以及不同物种的鱼肌肉在不同贮藏条件下的动态变化[3,6]。鉴于对鱼类水产品的需求日益增长，所以保证和控制其安全生产具有重要的意义[1]。蛋白质组学技术将在功能蛋白质开发、鱼类病原体检测、鱼类过敏原分析以及品质相关蛋白质标志物的筛选、鱼类品种鉴定等研究领域发挥着越来越重要的作用[3,7]。

1 蛋白质组学技术

双向电泳（2-DE）是蛋白质组学技术的基础方法之一，即先将样品蛋白质根据其等电点在pH值梯度胶内进行等电聚焦，按照它们等电点的不同进行分离；然后按照它们的相对分子质量大小进行第二次电泳分离。样品中的蛋白经过等点电和分子质量的两次分离后，可以得到分子的等电点、分子质量和表达量等信息[8]。Unger等[9]考虑使用 MDLC（Multi-dimentionsional HPLC）代替双向电泳来高分辨率地分离复杂的蛋白组混合物。而Lubman等[10]开发了针对全蛋白并结合了多种液相分离方法的二维分离体系。这些方法的延伸显著提高了蛋白质的分辨率和稳定性，促进了蛋白质组学技术的发展。20世纪80年代末，karas[11]和 Fenn[12]先后发明的基质辅助激光电离（MALDI）和电喷雾电离（ESI）技术可以应用到蛋白质的结构分析中。质谱仪的发展推进了蛋白质组学的应用，目前常用于蛋白质组学的商业化仪器包括MALDI-飞行时间质谱仪、ESI-三级四级杆质谱仪、ESI-四级离子阱质谱仪以及基质辅助激光电离-离子阱质谱仪、傅里叶回旋共振质谱仪、电喷雾-四级-飞行时间质谱仪等[8]。

2 蛋白质组学技术在鱼类安全生产中的应用

2.1 鱼类物种的鉴定

由于鱼类加工产品在市场的越来越流行，鱼类物种认证正迅速成为一个重要的研究领域，具有重要的商业意义。目前已经存在的技术有以DNA为基础的物种鉴定[13]，确定原产地的同位素分布技术[14]等，但都存在一定的问题。蛋白质组学技术被证明在这方面是一个强有力的工具，特别是能解决生物安全状况，养殖的压力和污染水平等方面的问题[15]。Martinez等[16]研究了利用蛋白质组学技术进行鱼类等物种的鉴定。由于与基因组不同，蛋白质组不是一个静态的实体，蛋白质会随着组织和环境条件的变化而变化，蛋白质组学有可能比基因组学的方法产生更多的信息，并可表明除了物种鉴定以外的有关品质和组织的信息。因此，虽然以DNA为基础的方法短期内将依旧是鉴定鱼类品种的首选方法，但是蛋白质组学技术有可能迅速发展，并在这个领域体现其商业价值的用途。较早的研究显示，蛋白质组学技术已被确认为鉴定鱼类物种的潜在方法。20世纪60年代的一维电泳技术的开发，就已经被用作鉴定和加工熟食产品的方法[17]，以识别各种不同原料物种[18-19]。最近，利用2-DE为基础的方法区分密切相关的不同物种，如鳕鱼和鲳鱼类，得到了较好的结果[20-21]。此外，Lope等[22]研究了3个物种 Mytilus edulis、Mytilus galloprovincialis 和 Mytilus trossulus，发现可以从凝胶上的原肌球蛋白的差异来区别Mytilus trossulus与其他两个物种，而这个差异仅由于一个氨基酸的替换。

2.2 鱼肉鲜度品质的评价

鱼肉鲜度品质的评价方法一般分为感官检验、物理检验、化学检验和微生物检验[23]。感官检验利用人的嗅觉、视觉、触觉、味觉来辨别肉品外观、气味、色泽、粘度及弹性的改变而鉴定鱼肉的质量变化[24]。物理检验是根据蛋白质分解，低分子物质增多，采用导电率、粘度、保水量的变化来衡量肉质[25]。化学检验是用定性或定量方法测定蛋白质分解产物，采用非蛋白氮作为鲜度的指示物质，如氨、胺类、挥发性盐基氮（TVB-N）、三甲胺（TMA）、吲哚等，从而衡量肉的变质程度。微生物检验则是利用微生物数量来说明肉类新鲜程度，如细菌菌落总数和大肠杆菌群近似数测定等[26]。结合蛋白质组学技术，可以通过蛋白质的分子变化，反映鱼肉的鲜度等品质。Inger等[27]利用2-DE技术研究发现，与新鲜的鳕鱼（Gadus morhua）比较，死后鳕鱼肌肉有11个蛋白质点的丰度发生了变化，其中8个蛋白质点的丰度显著增加，后续分析表明这些蛋白质点是肌原蛋白、肌浆蛋白、肌肉纤维等肌肉组织的分解产物。由此可见，蛋白质组学技术对评价鱼肉鲜度等品质具有重要的现实意义。

2.3 鱼肉的生物化学组成分析

鱼类的肌肉除水分以外，主要由蛋白质和脂肪组成。其中脂肪由于含有大量易氧化的多不饱和脂肪酸而引起酸败，尤其是含有较高脂肪的鱼类在储存过程中酸败会增加，最终导致产品质量下降[28]。然而，脂肪氧化无法解释鱼肉在储存过程中硬度的增加等性质的变化，尽管研究人员对蛋白质氧化开展了部分研究，但目前还不清楚是蛋白质氧化引起脂肪氧化，还是脂肪氧化引起蛋白质氧化[29]。就蛋白质氧化的研究方面等[30]采用蛋白质组学技术研究了大西洋鳕鱼贮藏过程中的几种蛋白质丰度的变化，并提出了鱼类死后肌肉蛋白质氧化和降解的一般途径，为蛋白质氧化的研究提供了一个新的分析方法。此外，通过整条鱼在不同自由基存在的条件下储存后得出了蛋白质氧化的整体水平，并就蛋白质氧化/鱼肉羰基化的方面通过多种方法进行了研究[31-32]。利用二硝基苯肼标记的蛋白质羰基的2-DE免疫印迹，揭示了包括实际数量、等电点、易氧化的蛋白质的质量等羰基化的蛋白质信息。这些研究从一定程度上揭示了鱼类蛋白质氧化水平和分子机制，从而为分析鱼类的生物化学组成，以最终确定适合人类食用的蛋白质的氧化水平和探究污染的鱼肉品质变化的过程提供参考[33]。

2.4 鱼类产品贮藏加工过程变化研究

Love等[34]早在1980年就综述了影响鱼类产品贮藏加工的各种因素。在鱼类产品的贮藏加工过程中，鱼类品质的变化在很大程度上取决于物种自身的理化组成等特性。进一步研究表明，一个生物体的表型，包括品质特性，是由环境以及遗传因素共同决定。Huss等[35]指出，相同鱼类产品的内部品质差异取决于饲喂标准和饲养条件，这些差异会影响其死后的生化过程，而这反过来又影响鱼类产品质量的变化。在猪、牛等陆地动物中，死前蛋白酶活动已被证明影响肉的品质和质地[36-37]，这就提示我们鱼类死后蛋白质分解可能对鱼类等水产品品质和安全具有相当重要的意义。结合蛋白质组学技术的研究表明，当以植物蛋白替代鳟鱼饲料中的鱼粉时，结果表明饲喂植物蛋白的鳟鱼肉硬度更高，汁液较少，显示了死前的代谢对产品的品质和结构的影响[38]。进一步研究表明游离氨基酸的数量和组成也受到了影响，饲喂鱼粉的鳟鱼鱼肉在贮藏期间精氨酸的丰度大大减少，相反饲喂植物蛋白的鳟鱼鱼肉在储存过程中精氨酸的丰度大大增加，这表明饲喂不同的蛋白质饲料对鱼死后蛋白质的水解活性同样具有重要的影响。此外，养殖方式的不同也会导致鱼死后体内生化反应的差异。Martinez等[39]发现，与野生的鳕鱼相比，人工养殖的鳕鱼2-DE图上蛋白质分子量在35～45 kDa之间存在显著差异点。目前蛋白质组学技术在鱼类产品贮藏加工过程中的研究还处于起步阶段，得到的研究结果有限。然而，鉴于蛋白质降解对鱼肉品质和加工特性有着显著的影响，借助于蛋白质组学技术的相关研究在这一领域内将有着相当广阔的前景。

3 研究展望

研究表明，蛋白质组学技术在探讨生活在极端环境中鱼类的生长、发育和品质等特性方面是一个强大的工具，可以提供极端环境条件下鱼类的代谢机制以及未知的生理功能，并且可能发现与人体健康相关的新的蛋白质分子。尽管到目前为止，蛋白质组学技术在鱼类生物学、水产养殖以及水产品品质中的应用研究仍很有限，但迄今已经完成的前期研究结果证明，蛋白质组学技术在研究与生理相关的蛋白质分子机制、鱼类生物标志物、鱼类品质变化评价、鱼类食品贮藏加工过程品质管理以及评估环境污染对鱼类安全生产的影响等方面均具有潜在的应用价值和发展前景。此外，随着现代分子生物学技术的发展，部分研究已经能够将蛋白质组学技术与其他基因组学技术、代谢组学技术等现代方法结合起来，为鱼类安全生产中的研究提供更为广泛的信息。鉴于此，预计在未来一段时间内，现有的蛋白质组学技术以及其他相关的新兴技术将更加广泛地应用于鱼类生物学和安全生产的研究。

[1]FAO.The State of World Fisheries and Aquaculture,2009.

[2]Forne I,Abia J,Cerda J.Fish proteome analysis:Model organisms and non-sequenced species[J].Proteomics,2010,10:858-872.

[3]Martínez I,Jakobsen F T,Friis T.Application of proteome analysis to seafood authentication[J].Proteomics,2004,4:347-354.

[4]McLean L,Young I S,Doherty M K,et al.Global cooling:cold acclimation and the expression of soluble proteins in carp skeletal muscle[J].Proteomics,2007,7:2667-2681.

[5]Monti G,De Napoli L,Mainolfi P,et al.Monitoring food quality by microfluidic electrophoresis,gas chromatography,and mass spectrometry techniques:effects of aquaculture on the sea bass(Dicentrarchus labrax)[J].Analytical Chemistry,2005,77:2587-2594.

[6]Kjærsgard I V H,Nørrelykke M R,Jessen F,et al.Changes in cod muscle proteins during frozen storage revealed by proteome analysis and multivariate data analysis [J].Proteomics,2006,6:1606-1618.

[7]Pineiro C,Barros-Velazquez J,Vazquez J,et al.Proteomics as a tool for the investigation of seafood and other marine products[J].J.Proteome Res.,2003,2:127-135.

[8]夏其昌，曾嵘蛋.蛋白质化学和蛋白质组学[M].北京:科学出版社,2004:144-274.

[9]Unger K K,Racaityte K,Wagner K,et al.Is multi-dimensional high performance liquid chromatography (HPLC)an alternative in protein analysis to 2-D gel electrophoresis[J].J.High Res.Chromatogr.,2000,23:259-265.

[10]Lubman D M,Kachman M T,Wang H X,et al.Two-dimensional liquid separation-mass mapping of protein from human cancer cell lysates[J].J.Chomatogr,B.2002,782:625-632.

[11]Karas M,Hillenkamp F.Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 Daltons[J].Anal.Chem.,1988,60:2299-2301.

[12]Fenn J B,Mann M,Meng C K,et al.Electrospray ionization for mass spectrometry of large bimolecular[J].Science,1989,246:64-71.

[13]Mackie I M,Pryde S E,Gonzales-Sotelo C,et al.Challenges in the identification of species of canned fish[J].Trends in Food Science and Technology,1999,10:9-14.

[14]Campana S E,Thorrold S R.Otoliths,increments,and elements:keys to a comprehensive understanding of fish populations?[J].Can J.Fish Aquat.Sci.,2001,58:30-38.

[15]Martinez I,Friis J T.Application of proteome analysis to seafood authentication[J].Proteomics,2004,4:347-354.

[16]Martinez I,Aursand M,Erikson U,et al.Destructive and non-destructive analytical techniques for authentication and composition analyses of foodstuffs[J].Trends in Food Science&Technology,2003,14:489-498.

[17]Mackie I M,Taylor T.Identification of species of heat-sterilized canned fish by polyacrylamide disc electrophoresis[J].Analyst,1972,97:609-611.

[18]Cowie W P.Identification of fish species by thin slab polyacrylamide gel electrophoresis[J].J.Sci.Food Agric.,1968,19:226-229.

[19]Mackie I M.Identification of fish species by a modified polyacrylamide disc electrophoresis technique[J].J.Assoc Public Anal.,1969,5:83-87.

[20]Piñeiro C,Barros-Velázquez J,Sotelo C G,et al.The use of two dimensional electrophoresis for the identification of commercial flat fish species[J].Z.Lebensm Unters Forsch,1999,208:342-348.

[21]Piñeiro C,Barros-Velázquez J,Sotelo C G,et al.Two-dimensional electrophoretic study of the water-soluble protein fraction in white muscle of gadoid fish species [J].J.Agric.Food Chem.,1998,46:3991-3997.

[22]Lopez J L,Marina A,Alvarez G,et al.Application of proteomics for fast identification of species-specific peptides from marine species[J].Proteomics,2002,2:1658-1665.

[23]ólafsdóttir G,Martinsdóttir E,Oehlenschläger,J,et al.Methods to evaluate fish freshness in research and industry [J].Trends Food Sci.Tech.,1997,8:258-265.

[24]沈月新.水产食品学[M].中国农业出版社.2001：19-35.

[25]Olafsdottira G,Nesvadbab P.Multisensor for fish quality determination[J].Trends Food Sci.Tech.,2004,15:86-93.

[26]沈月新.水产食品学[M].中国农业出版社.2001:77-80.

[27]Inger V H,Kjaersgard I V,Jessen F J,et al.Proteome Analysis Elucidating Post-mortem Changes in Cod(Gadus morhua)Muscle Proteins[J].J.Agric.Food Chem.,2003,51:3985-3991.

[28]Frankel E N.Foods.//Lipid Oxidation [M].Frankel,E.N.,Ed.Bell and Bain:Glasgow,Scotland,1998.

[29]Soyer A,Hultin H O.Kinetics of oxidation of the lipids and proteins of cod sarcoplasmic reticulum [J].J.Agric.Food Chem.,2000,48:2127-2134.

[30]Kjærsgård I V,Jessen F J.Proteome analysis elucidating postmortem changes in cod(Gadus morhua)muscle proteins[J].J.A－gric.Food Chem.,2003,51:3985-3991.

[31]Saeed S,Howell N K.Effect of lipid oxidation and frozen storage on muscle proteins of Atlantic mackerel(Scomber scombrus)[J].J.Sci.Food Agric.,2002,82:579-586.

[32]Srinivasan S,Hultin H O.Chemical,physical,and functional properties of cod proteins modified by a nonenzymic free-radical generating system[J].J.Agric.Food Chem.,1997,45:310-320.

[33]Inger V H,Kjaersgard I V,Jessen F J,et al.Two-dimensional gel electrophoresis detection of oxidation in fresh and tainted rainbow trout muscle[J].J.Agric.Food Chem.,2004,52:7101.

[34]Love.R.M.Biological factors affecting processing and utilization.In:advances in fish science and technology[M].Connell,J.J.,Ed.Aberdeen:Fishing News Books.,1980.

[35]Huss H H.quality and quality changes in Fresh Fish [M].Rome:FAO.,1995.

[36]Kristensen L,Therkildsen M,Riis B,et al.Dietary induced changes of muscle growth rate in pigs:Effects on in vivo and postmortem muscle proteolysis and meat quality[J].J.Anim.Sci.,2002,80:2862-2871.

[37]Vaneenaeme C,Clinquart A,Uytterhaegen L,et al.Postmortem proteases activity in relation to muscle protein-turnover in Belgian blue bulls with different growth-rates[J].Sci.Alim.,1994,14:475-483.

[38]Francesco M De,Parisi G,Médale F,et al.Effect of long-term feeding with a plant protein mixture based diet on growth and body/fillet quality traits of large rainbow trout(Oncorhynchus mykiss)[J].Aquaculture,2004,236:413-429.

[39]Martinez I,Slizyte R,Dauksas E,et al.High resolution two-dimensional electrophoresis as a tool to differentiate wild from farmed cod(Gadus morhua)and to assess the protein composition of klipfish[J].Food Chemistry,2007,102:504-510.