ICU病房鲍曼不动杆菌的耐药表型及 β内酰胺酶基因型检测

(胜利油田中心医院,山东东营 257034)

近年来随着广谱抗生素的使用,鲍曼不动杆菌对临床常用抗生素的耐药性逐年增加[1]。2005年 1月～2010年 6月,本研究对 309株鲍曼不动杆菌耐药表型和常见 β-内酰胺酶基因类型进行检测。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 309例鲍曼不动杆菌菌株分离自胜利油田中心医院 ICU病房确诊鲍曼不动杆菌感染的患者痰、创面分泌物、血、尿、胆管引流液、大便、脑脊液、胸水、腹水。使用 VITEK60细菌自动鉴定仪及NFC鉴定卡鉴定菌种,标准菌株为大肠埃希菌ATCC25922和铜绿假单胞菌 ATCC27853。抗菌纸片亚胺培南(IPM)、哌拉西林(PIP)、哌拉西林 /他唑巴坦(TZP)、氨苄西林/舒巴坦 (ASM)、头孢他啶(CAZ)、头孢吡肟(FEP)、头孢哌酮 /舒巴坦(SCF)、阿米卡星(AK)、复方新诺明(SXT)、左旋氧氟沙星(LEV)、氨曲南(ATM)、头孢噻肟(CTX)、头孢曲松(CRO)。M-H培养基。

1.2 鲍曼不动杆菌菌株耐药表型检测 采用 K-B纸片扩散法。实验方法和判读标准均按照美国 NCCLS规定(M 100-S21-2011版)进行。

1.3 鲍曼不动杆菌菌株 β-内酰胺酶类型检测 采用改良三维试验大平皿法。以 Nitrocefin纸片鉴定出现红色为阳性结果,1 h后无颜色变化为阴性。以超声破碎法制备 β-内酰胺酶粗提物,头孢硝噻吩显色法检测提取物。按照文献[2]的方法操作,加入待测样本,放置平皿于 35℃温箱过夜培养 18～24 h,平皿上抑菌圈出现变形为阳性,反之为阴性。

1.4 鲍曼不动杆菌菌株 β-内酰胺酶基因类型的检测 分别采用 Qiagen Plasmid Minikit及手工碱裂解法提取质粒。①单一引物 PCR扩增法检测 OXA型β-内酰胺酶基因 OXA-23、OXA-24,方法参考文献[3]。②多重引物 PCR扩增法检测 ESBLs和AmpC酶基因,ESBLs的 3对引物及 AmpC的 6对引物设计及 PCR反应步骤参考文献[4]。将所得扩增产物经琼脂糖凝胶电泳观察,并用凝胶成像系统扫描成像进行分析。

2 结果

2.1 鲍曼不动杆菌对 13种抗菌药物的耐药率2005年鲍曼不动杆菌对 IPM、AK、SXT、ASM、FEP、CAZ、TZP、PIP、ATM、CTX、CRO的耐药率分别为5.0%、15.2%、20.3%、21.4%、18.8%、20.5%、30.0%、38.4%、18.8%、18.6%、19.9%;2006年鲍曼不动杆菌对 IPM、AK、SXT、ASM、FEP、CAZ、TZP、PIP、SCF、LEV、ATM、CTX、CRO的耐药率分别为6.0%、21.4%、25.8%、34.2%、20.5%、14.3%、40.3%、50.4%、10.3%、11.3%、20.5%、11.9%、14.5%,2007年分别为 3.0%、19.5%、24.1%、42.5%、25.8%、30.4%、33.3%、46.3%、29.1%、19.2%、25.8%、45.6%、31.1%,2008年分别为2.7%、22.5%、27.6%、32.6%、35.4%、40.2%、47.1%、61.2%、38.8%、22.6%、35.4%、46.6%、39.6%,2009年分别为 3.6%、23.3%、25.3%、23.1%、42.8%、36.1%、56.2%、77.4%、47.2%、34.5%、42.8%、33.2%、28.9%,2010年分别为3.2%、29.5%、35.1%、23.5%、40.2%、34.2%、33.2.%、58.2%、39.1%、23.1%、40.2%、30.6%、33.5%。

2.2 菌株 β-内酰胺酶类型检测结果 309株鲍曼不动杆菌中,294株产 β-内酰胺酶。其中 171株能经改良三维试验大平皿法进行酶分型:单独产碳青霉烯酶 6株、产 EsBLsls 23株、产 AmpC酶 8株 ,产IRTsls 27株;同时产碳青霉烯酶和 ESBLs的有 8株,产 AmpC酶和 ESBLs的有 13株,同时产碳青霉烯酶和 IRTs的有 10株 。

2.3 PCR扩增电泳结果 在 IMP中介或耐药的 53株鲍曼不动杆菌中,有 11株扩增到 blaOXA-23。对CTX/CAZ均耐药的 183株鲍曼不动杆菌中,产 ESBLs组 75株,多重 PCR检测到 12株阳性,分别携带blaCTX-M-13、blaCTX-M-14各 3株,同时携带blaSHV和 blaCTX-M-1共 6株 ;产 ESBLs组 108株中多重 PCR均阴性。对 FOX中介或耐药的 281株鲍曼不动杆菌中,产 AmpC酶组 36株,多重 PCR仅检测到 3株 AmpC基因阳性。不产 Ampc酶组 245株,多重 PCR检测到 5株携带 blaDHA。

3 讨论

鲍曼不动杆菌以其生存能力强、耐药率高已成为重要的院内感染条件致病菌,可引发肺部院内感染、败血症、泌尿系感染、继发性脑膜炎等[5]。

本研究中,鲍曼不动杆菌对 β-内酰胺类抗生素耐药率除 IPM外均在 27.9%～77.9%。其对头孢SCF及 ASM耐药率相对较低,因为舒巴坦可抑制 β-内酰胺酶,又可通过作用于细菌的青霉素结合蛋白(PBP)而在体内增强其抗药活性[6]。氨基糖甙类抗生素中,AK耐药率较低(29.5%),但该药单独使用疗效不佳。LEV耐药率达到 39.3%,这与近年来临床大量使用这类药物有关。本研究结果显示,鲍曼不动杆菌对 IPM耐药率最低(＜3.6%),可能与该药临床应用时间较短,且抗菌作用强、与第三代头胞菌素无交叉耐药性、对多数 β-内酰胺酶稳定有关[6]。

本研究采用 OXA-23、OXA-24两种酶基因引物将对 IPM中介或耐药的 53株鲍曼不动杆菌的基因进行 PCR扩增,结果发现,11株 blaOXA-23阳性,blaOXA-24阴性。而感染携带 blaOXA-23基因的鲍曼不动杆菌(33株)者,其临床资料完整的 25例中有 23例被诊断为院内感染,说明存在对 IPM耐药的鲍曼不动杆菌医院感染流行,且基因型为blaOXA-23。产 OXA-23型和 0XA-6型碳青霉烯酶可能是鲍曼不动杆菌对 IPM、美罗培南等碳青霉烯类药物耐药的主要机制[7]。

目前已知大肠杆菌、肺炎克雷伯杆菌、鲍曼不动杆菌等易生产 ESBLs,AmpC酶由肠杆菌科细菌或绿脓假单胞菌的染色体或质粒介导产生。本研究对鲍曼不动杆菌的 ESBLs、AmpC酶两种 β-内酰胺酶基因进行多重 PCR检测,仅发现 3株 ESBLs基因型阳性,5株 AmpC酶基因型阳性,两者阳性率均低。说明鲍曼不动杆菌中这些基因型者可能属于散发,可能与耐药鲍曼不动杆菌医院感染流行无关。然而该结果提示肠杆菌科细菌和铜绿假单胞菌向鲍曼不动杆菌质粒的水平传递已经存在。

此外,本研究对于整合子所导致细菌多药耐药检测没有涉及。整合子可造成多种耐药基因在不同菌株其至不同菌种间的水平转移,对其进行研究,也有助于做好细菌耐药性的监控工作[8]。

[1]潘晓龙,周东升,富铮,等.鲍曼不动杆菌耐药监测及氨基糖苷修饰酶基因分布[J].国际检验医学杂志,2007,28(4):298-303.

[2]Jiang XF,Hong XH,Sun JY,et al.Analysis of beta-lactamase in multi-resistantpseudomonasaeruginosa[J].Chin JMicrobiol Immunol,2002,22(4):443-446.

[3]Bou G,Oliver A,Martinez-Beltran J.OXA-24,a novelclass Dβlactamase with carbapenemaseactivity in an acinetobacter baumannii clinical strain[J].Antimicrob Agents Chemother,2000,44:1556-1561.

[4]Lewis JS,Herrera M,Wickes B,et al.First reportof the emergence of CTX-M-type extended-spectrum beta-lactamases(ESBLs)as the predominant ESBL isolated in a U.S.health care system[J].Antimicrob Agents Chemother,2007,51:4015-4021.

[5]朱旭慧,孙自镛,简翠,等.不动杆菌属的耐药性分析[J].中国抗感染化疗杂志,2005,5(6):342-345.

[6]王春新,谢国强,严子禾,等.耐亚胺培南细菌的临床分离及耐药谱分析[J].国外医学:临床生物化学与检验学分册,2005,26(9):666-667.

[7]周东升,潘晓龙,王传发.耐亚胺培南鲍曼不动杆菌产碳青霉烯酶基因型研究[J].国际检验医学杂志,2010,31(7):631-633.

[8]唐吉斌,周东升,徐元宏.整合子在鲍曼不动杆菌耐药中的作用研究[J].国际检验医学杂志,2010,31(5):420-424.