猪繁殖与呼吸综合征病毒研究进展



猪繁殖与呼吸综合征病毒研究进展

迟 兰 汪鹏旭 丁文卫（徐州生物工程职业技术学院 江苏徐州 221006）

猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的接触性传染病，主要引起怀孕母猪后期流产、早产、死胎和木乃伊胎增多，仔猪出现呼吸道症状和断奶前死亡率增高。该病最早于1987年发生于美国的北卡罗纳、衣阿华等州，随后在短短的几年时间内，迅速遍及全球各养猪业发达的国家和地区(北美洲，1987；欧洲，1990；亚洲，1991)。1991年，荷兰科学家Wensvoort 博士首次从感染猪体内分离到该病毒，并命名为Lelystad病毒(LV)，1992年美国研究人员用CL2621细胞也分离到PRRSV，并命名为VR-2332毒株[1]。虽然世界各地所分离的PRRSV可引起类似的症状，但根据资料显示，PRRSV在毒力性、抗原性以及遗传性方面均有很大的差异，根据基因序列以及抗原性差异，将PRRSV分为A、B两个亚群。A亚群即以LV为代表的欧洲型毒株，B亚群即以VR-2332株为代表的美洲型毒株。二者的基因组核苷酸一致性仅55%~70%，但其形态结构、复制特点、细胞嗜性、流行传播方式及其引发的疾病特征等生物学特性均相同。目前亚洲的日本、韩国、菲律宾等国也有该病报道。1995年国内某些猪场发生流产、死胎等繁殖疾病，1996年哈尔滨兽医研究所在国内首次分离到PRRSV，证实本病在国内存在[2]。

1 PRRSV的一般特性

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)为不分节段、聚腺苷酸化、有囊膜的正链单股RNA病毒，属于尼多病毒目、动脉炎病毒科、动脉炎病毒属。成熟的病毒粒子直径约50~72nm，核衣壳直径约20~30nm，呈20面体对称。在蔗糖中的浮密度为1.13~1.15g/ml，在氯化铯中的浮密度为1.18~1.19g/ml，本病毒不能凝集猪、羊、牛、鼠、马、鸭、鸡以及人O型红细胞。PRRSV对温度敏感，-20℃以下可长期保存，4℃以上保存一周后感染性丧失90%，但30d后仍可检出有感染性的病毒粒子。将PRRSV阳性血清保存于25℃环境中，24h后病毒分离率为47%，48h后分离率下降到14%，而72h后分离率仅为7%，因此，在进行病毒分离时，病料必须在低温下保存和运输。PRRSV对pH值敏感，在pH低于6.0或高于7.5时，很快丧失活力。病毒粒子对乙醚、氯仿等脂溶剂也非常敏感[3]。囊膜破坏后，其核心粒子无感染性。

2 PRRSV的分子生物学特性

2.1 PRRSV的复制特性 PRRSV基因组全长约15kb，有8个开放性阅读框架(ORFs)，基因组5’端有一段非编码区5’NCR序列，随后是复制酶基因ORF1a、ORF1b和结构蛋白基因ORF2-7、以及3’非编码区和Poly(A)结构。其中ORF1a、1b占整个基因组的75%以上。大多数ORF之间形成长短不一的部分重叠。PRRSV基因组RNA通过不连续的转录机制产生一系列的亚基因组mRNA，这些亚基因组mRNA的5’端都具有一个来自于基因组RNA 5’NCR的共同的前导序列，并且形成一个共3’端的嵌套式结构，这也正是尼多病毒目的特征。

2.2 病毒基因组编码的蛋白质 PRRSV基因组编码的蛋白有复制酶、聚合蛋白和结构蛋白。ORF1编码复制酶和聚合蛋白，是唯一的非结构蛋白，参与病毒的复制。ORF1a编码的聚合蛋白经裂解后产生6个非结构蛋白(NSP1α，NSP1β和NSP2~5)。其中NSP2的氨基酸序列在美洲株和欧洲株之间的同源性仅有32%，实验表明NSP2基因中含有B细胞表位免疫的优势基因；NSP1α和NSP1β包含两个类木瓜蛋白酶的半胱氨酸蛋白酶区。ORF1b编码的聚合蛋白长约1463个氨基酸，被ORF1a编码的蛋白酶切割后形成RdRp、CP2、CP3、CP4个蛋白。

GP2为结构糖蛋白，由ORF2编码，分子量为29~30kDa，有两个明显的疏水峰和糖基化位点，LV的GP2能整合入病毒粒子中。GP2肽链内含有二硫键，通过二硫键可和其他结构蛋白形成同源或异源多聚体，其糖基化位点被N-聚糖复合物覆盖。GP2蛋白表面有一个抗原位点，其周围有一个VSRRIYQ基元，可与GP5蛋白B细胞抗原位点构成二级结构。GP2蛋白免疫原性很差，在病毒中含量较少，很难从感染的细胞裂解液或纯化的病毒粒子中得到分离鉴定。

GP3为高度糖基化蛋白，具有7个糖基化位点，分子量为40~50kDa，含265个氨基酸。现在对GP3是否为结构蛋白尚无定论。GP3蛋白羧基端有一个与病毒血清型有关的非中和抗原表位，其可能引起病毒基因型抗原性的差异。GP3是PRRSV各毒株间保守性最差的蛋白之一，在欧、美型毒株间推导氨基酸的同源率为54%~60%，而且多数变异发生在N末端。Duran等人用杆状病毒表达载体表达了PRRSV ORF3的产物，表达产物可给猪提供68.4%的保护率，说明ORF3表达产物在抵抗病毒感染时具有一定作用。

GP4蛋白是病毒的主要结构蛋白之一，分子量约为31~35kDa，有4个糖基化位点，其N端和C端有高度的疏水区。该蛋白氨基端有一信号肽序列，在GP4蛋白胞外区第40~79位氨基酸之间有一个可与单抗发生中和反应的抗原决定簇，该区域在不同的PRRSV中高度可变，它可能与免疫选择有关。

GP5为糖基化的囊膜蛋白，又称E蛋白，分子量约为26~30kDa，含4个糖基化位点和一段31个氨基酸的信号肽，该蛋白含有一段很大的内部疏水区。E蛋白与M蛋白在囊膜内由二硫键结合成异源二聚复合物，其内含有与病毒有关的免疫重要区。GP5有6个抗原决定簇，能诱导机体产生特异性中和抗体，另有报道，GP5可诱导并引发细胞凋亡。

ORF6编码非糖基化蛋白，也称M蛋白，分子量为18~19kDa。VR-2332型和LV型分别含有174和173个氨基酸。M蛋白的N端有3个疏水性跨膜区，针对该蛋白的单抗从欧洲和北美洲的分离株中识别出2个共同和1个独特的抗原决定簇。M蛋白在所有的PRRSV株间高度保守，在欧、美型毒株间也最为保守。通过感染猪康复血清的Western免疫印迹试验证明了M蛋白具有很强的免疫性，感染后10d就可以检测该抗体应答。表达重组的M蛋白可作为血清学实验的靶抗原。

ORF7编码核衣壳(N)蛋白，分子量为13.8~15kDa，碱性，亲水性，具有一个糖基化位点，但非糖基化蛋白。北美洲型和欧洲型分离株分别含有123个和128个氨基酸。N蛋白有6个疏水区及至少5个抗原决定簇，其中既有对所有毒株保守的共同决定簇，又有北美洲各型和欧洲各型的特异性决定簇。N蛋白在病毒粒子中含量较高，约占病毒蛋白总量的20%~40%，具有较高的免疫原性。通过Western-blot证明猪感染PRRSV后最早出现(大约7d)的是针对N蛋白的抗体，且该抗体可持续存在半年以上，因此N蛋白可作为PRRSV抗体的检测抗原，无论早期还是晚期都有重要的诊断学意义；但此抗体为非中和抗体，对机体无保护作用，无免疫学价值[4]。

3 PRRSV的遗传变异

PRRSV各毒株之间，尤其是欧洲分离株与北美分离株之间存在很大的差异。尽管不同PRRSV分离株引起同一疾病，但用多克隆抗血清或单克隆抗体进行的血清学试验证实毒株之间存在显著的抗原多样性，这可能是由于结构蛋白氨基酸出现广泛变异所致。

北美洲型毒株之间也存在广泛的差异。Andreyev等分析了分离自美国、加拿大和危地马拉的22株PRRSV ORF5序列，它们与VR-2332 ORF5编码氨基酸的同一性在89%~94%之间，其中还有两株只有2个(大多数是3个)糖基化位点。因此，有人将北美洲型进一步划分为3个亚型。

Yoon等用5种针对核衣壳蛋白的单抗评价了1989~1993年间分离自美国22株分离物之间的抗原关系，根据其反应性不同而将其划分为3群。Yang等曾经用23种单抗将美国1989~1995年间分离的70株病毒分为5群，抗原变异归因于群特异性的单碱基置换，LV迥异于北美洲分离株而成为一个独特的抗原群。Drew等用6种针对核衣壳蛋白的单抗对25株欧洲分离株间的抗原关系进行了比较，发现欧洲毒株也存在抗原变异。

对基因组的基因序列分析比较从分子遗传学上阐释了血清学试验所证实的抗原多样性[4]。ORF7是极为保守的病毒基因，北美洲毒株间ORF7氨基酸同一性高达95%~100%，而与欧洲型毒株间ORF7氨基酸同一性只有57%~59%；ORF6是北美洲毒株与欧洲型毒株间最为保守的病毒基因，氨基酸同一性可达70%~81%；ORF2-4氨基酸同一性分别为91%~99%、86%~98%和92%~99%[5]。这些证据表明，PRRSV分离株可区分成两种不同的基因型，即欧洲型(代表毒株为LV)和北美洲型(代表毒株为VR-2332)。欧洲地区主要流行欧洲型，而美洲和亚太地区则以后者为主要毒型。

不同分离株对不同阶段的妊娠母猪的致病性差别很大，这表明各毒株在毒力上有所不同。有的猪群已发生PRRS血清学阳转，却没有明显的繁殖障碍，这可能是由于该毒株对生殖系统的毒力已经减弱造成的。随着病毒与宿主和环境的相互作用而具有不同的毒力特征，这有助于解释现地常见的亚临床感染现象。

4 中国PRRSV分子生物学研究

4.1 分子克隆 蔡家利等[6]克隆了PRRSV美国弱毒疫苗株PRMV株ORF6和ORF7，并进行了序列测定和比较。仇华吉等[7]克隆了CH-1a株的全部结构蛋白基(ORF2-ORF7)。研究表明，主要免疫原性基因ORF3和ORF5的体外表达产物可诱导保护性免疫，因此ORF3和ORF5的分子克隆为下一步构建重组疫苗或者基因疫苗奠定了基础。ORF7编码的保守性核衣壳蛋白是PRRSV的重要结构蛋白，它是现代血清学试验的抗原基础，具有诊断学意义，克隆ORF7是研制重组抗原的必要前提。

4.2 序列测定与分析 姜平等[8]扩增了华东和华北分离株的ORF5、ORF6和ORF7，并测定了序列，与VR-2332株核苷酸同一性均为99%，同源性如此之高是PRRSV罕见的。姜平等对华东和华北分离株ORF5-7也进行了序列分析。仇华吉等测定了CH-1a株ORF2、ORF3、ORF4、ORF5、ORF6和ORF7的核酸序列，并与国外参考毒株序列进行了比较分析。CH-1a株ORF2与美洲型标准毒株VR-2332株和欧洲型株毒株LV株核苷酸同一性分别为95.3%和64.2%，氨基酸的同源性为95.3%和62.9%；CH-1a株ORF3与VR-2332株还有LV株核苷酸同一性为91.5%和65.3%，氨基酸的同源性分别为88.6%和61.9% ；ORF4与VR-2332株还有LV株核苷酸同一性91.6%和63.5%，氨基酸的同源性分别为92.1%和70.5%；ORF5与VR-2332株还有LV株核苷酸同一性为92%和65.4%，氨基酸的同源性分别为93%和61%；ORF6与VR-2332株还有LV株核苷酸同一性为94.9%和70.2%，氨基酸的同源性分别为97%和81%；ORF7与VR-2332株、IAF-exp01株(加拿大参考毒株)和LV株核苷酸同一性为94.6%、93%和66.1%，氨基酸的同源性分别为97.6%、97%和68.8%。根据ORF5和ORF7绘制的系统发育进化树表明CH-1a株与VR-2332株可能来源于同一祖先。利用有关软件分析了ORF2、ORF3、ORF4、ORF5、ORF6和ORF7编码产物的等电点、糖基化位点、疏水性、抗原性和有关位点，积累了PRRSV分子生物学和分子流行病学资料。

4.3 体外表达 仇华吉等利用原核表达系统高校表达了CH-1a株ORF7，表达产物具有特异性免疫活性，为重组诊断抗原的生产奠定了基础。ORF5的真核表达质粒和ORF7的杆状病毒载体也已经构建成功，表达蛋白的研制和应用正在进行中。

[1] Collins JE, Benfield DA, Vhristianson WT, et al. Isolation of swine infertility and respiratory syndrome virus (isolate ATCC VR-2332) in North America and experimental reproduction of disease in gnotobiotic pigs. J. Vet. Diagn. Invest.1992, 4:117-126.

[2] Allende R, Lewis TL, Lu Z, et al. North American and European porcine reproductive and 1999, 80:307-315.

[3] Jusa ER, Inaba Y, Kohno M, et al. Hemagglutination with porcine reproductive and respiratory syndrome virus. J. Vet. Med. Sci. 1996, 58:521-527.

[4] Drew TW,Meulenberg JJM,Sands JJ,et al.Production,characterization and reactivity of monoclonal antibodies to procine reproductive and respiratory syndrome virus.J Gen Virol 1995,76:p1361-1369

[5] Meng XJ ,Paul PS,Halbur PG,et al.Phylogenetic analyses of the putative M(ORF6) and N(ORF7) genes of procine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV):implication for the existence of two genotypes of PRRSV in the USA and Europe.Arch Virol,1995b,140: 745-755.

[6] 蔡家利,姜平,蔡宝祥,马志勇. 猪繁殖和呼吸综合征病毒基质膜蛋白和核衣壳蛋白基因的克隆与鉴定. [J]中国兽医学报, 1999(1).

[7] 仇华吉, 郭宝清, 童光志等.猪繁殖-呼吸综合征病毒CH-Ia株基因型鉴定[J]. 中国兽医学报.1998, 18(2): 118-121.

[8] 姜平, 陈溥言, 蔡宝祥. 猪繁殖和呼吸综合征病毒分子生物学研究进展[J]. 中国兽医杂志, 1998(12).

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1007-1733(2011)01-0064-03

（2010–11–21）