炎症介质和细胞因子在急性脑缺血模型大鼠肠道细菌移位中的作用

刘 菁，王燕斌

(1华北电网有限公司北京电力医院，北京100073;2首都医科大学附属北京天坛医院)

大量的研究表明，严重创伤、烧伤、重症胰腺炎、急性脑血管病等应激状态下，患者的肠黏膜屏障(IMB)功能常发生变化，肠黏膜通透性升高，导致细菌移位，形成肠源性感染，是诱发全身炎症反应综合征(SIRS)甚至多器官功能障碍综合征(MODS)的根本原因［1］。我们在前期的研究中也观察到急性脑缺血大鼠IMB的应激性变化［2］，但这一损伤发生的具体机制尚不清楚。2010年2～8月，本实验拟通过对急性脑缺血大鼠门静脉血内毒素(ET)、肿瘤坏死因子 α(TNF－α)以及肠黏膜组织中一氧化氮(NO)水平的变化与细菌移位关系的研究，探讨急性脑血管病患者IMB功能应激性变化的发生机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 64只12周龄健康雄性Wistar大鼠，体质量200～250 g，由中国科学院遗传与发育生物学研究所动物中心提供，随机分为脑缺血模型组(模型组)和假手术对照组(对照组)。两组大鼠分别于术后6、12、24和48 h进行相关指标观察和测定，各时相点均为8只。

1.2 方法

1.2.1 脑缺血模型的制备 大鼠实验前12 h始禁食不禁水，模型组采用Kuge等［3］报道的线栓模型稍加改进。用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后(40 mg/100 g)，仰卧固定于手术台上，颈部正中切开，逐层分离组织，暴露左侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉，结扎左侧颈总动脉近端、颈外动脉根部。在左侧颈总动脉结扎处远端剪一斜口，经此斜口插入尼龙丝，经左侧颈总动脉分叉处通过颈内动脉入颅阻断大脑中动脉的血流。尼龙丝插入深度为(18.5±0.5)mm。结扎颈内动脉以固定尼龙丝和防止出血，缝合皮肤，尼龙丝末端暴露在外。模型成功的标志为:手术麻醉苏醒后，大鼠右侧偏瘫，右下肢伸直，站立不稳，向一侧转圈。对照组分离血管后除不插入尼龙丝外其余步骤与模型组相同。

1.2.2 血清ET和TNF－α的测定 各组动物处死前，在无菌条件下取门静脉血1 ml，采用偶氮显色法鲎实验定量测定ET;双抗体夹心ABC－ELISA法测定 TNF－α。

1.2.3 肠黏膜NO的测定 取末端回肠，剔除系膜，清除肠内容物后刮取黏膜组织200 mg，按需分别制成10%和1%的匀浆，采用南京建成生物工程研究所的试剂盒，硝酸还原酶法测定NO。

1.2.4 肠道细菌移位的测定 各组大鼠处死前6 h，管饲丫啶橙标记的大肠埃希菌(ATCC25922)菌液(1 ml/100 g体质量)。按各时间点活杀动物后，在严格无菌条件下取肠系膜淋巴结(MLN)、肺、脾、胰、肝、肾各0.1～0.3 g，制成10%的组织匀浆涂片。荧光显微镜下观察标记细菌是否存在，计算检出率。每个器官各时间点的检出率=标记菌阳性的例数/该时间点总例数(8只);各组细菌总检出率=标记菌阳性脏器总数/观察脏器总数。

1.2.5 统计学方法 采用SPSS11.0统计软件，结果用±s表示;组间比较采用非配对t检验，以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组ET、TNF－α及NO水平变化 见表1。

表1 两组ET、TNF-α及NO水平变化(n=8，±s)

注:与对照组比较，*P＜0.05

?

2.2 标记菌移位情况 对照组各时相点仅在MLN、肝和肺检到少量荧光标记菌，术后 6、12、24、48 h标记菌总检出率分别为2.1%、4.2%、2.1%和0，缺血组各脏器的标记菌检出率显著升高，术后6、12、24、48 h标记菌总检出率分别为 11.4%、18.8%、25.0%和12.5%，P均＜0.05。

3 讨论

生理情况下，结构完整的肠黏膜由于其完善的屏障功能能有效地阻止肠道内细菌侵入体内其他脏器，但在严重创伤、烧伤、手术、放化疗等应激状态或免疫抑制时，肠黏膜首当其冲受到影响。本实验用测定荧光标记大肠杆菌移位的方法来反映肠黏膜的通透性，结果显示，在急性脑缺血后早期，IMB功能已遭受破坏，导致肠黏膜通透性升高，从而使细菌移位明显增加。

关于应激造成胃肠黏膜损伤的机制，国内外学者进行了大量研究，其中肠黏膜的低灌注、氧自由基损伤、细胞因子作用被认为是应激性胃肠黏膜病变的三大主要致伤因素。关于急性脑血管病后缺血缺氧以及氧自由基与IMB功能损伤的关系我们之前已作过报道［2，4］，本实验主要针对细胞因子在这一病理生理过程中的作用进行研究。实验中我们选取了ET、NO、TNF－α作为细胞因子和炎症介质的代表［5～7］。本研究表明急性脑缺血后早期，ET水平即开始升高，随之是TNF－α、NO等炎症介质出现的高峰，之后，ET水平达到其峰值，同时标记菌的移位率也达到高峰，这与大多数研究中ET水平峰值先于细胞因子峰值出现的结果有所不同。我们分析认为，急性脑缺血后因为缺血缺氧等因素造成IMB功能一定程度的损伤，ET开始入血，之后激活单核—巨噬细胞系统产生大量的TNF－α，以自分泌和旁分泌的方式在局部起作用，从而诱导其他炎症性介质的产生和释放，如 IL－1、IL－6、IL－8 等，扩大其生物学效应［8］。而此时形成的炎症介质和细胞因子的高峰，使IMB功能进一步受损，随之而来的是大量ET的集中入血和肠道细菌移位，形成循环中ET的高峰，参与此过程的炎症介质和细胞因子构成网络，彼此促进相互叠加，如此恶性循环推动了SIRS/MODS的发生发展，这基本符合“二次打击”的理论［9］。

总之，肠道是应激反应的中心器官，它不仅是MODS的靶器官，更是MODS的发动者。积极干预急性脑缺血后肠黏膜的应激性变化，维护IMB功能，防止ET和细菌移位，抑制细胞因子的产生和释放，在阻断急性脑血管病患者SIRS甚至MODS的发生，改善其预后有重要的临床意义。

［1］ Dervenis C，Smailis D，Hatzitheoklitos E.Bacterial translocation and its prevention in acute pancreatitis［J］.J Hepatobiliary Pancreat Surg，2003，10(6):415－418.

［2］刘菁，王燕斌.急性脑缺血模型大鼠胃肠黏膜血流变化及组织形态学的改变［J］.中华老年医学杂志，2006，25(7):539－542.

［3］Kuge Y，Minematsu K，Yamaguchi T，et al.Nylonmonofilament for intraluminal middle cerebral artery occlusion in rats［J］.Stoke，1995，26(9):1655－1658.

［4］刘菁，王燕斌.氧自由基在急性脑缺血大鼠肠道细菌移位中的作用［J］.内科急危重症杂志，2007，13(1):17－18.

［5］Schwacha MG，Knoferl MW，Chaudry IH.Does burn wound excision after thermal injury attenuate subsequent macrophage hyperactivity and immunosuppression ［J］.Shock，2000，14(6):623－628.

［6］Chen J，Zhou YP，Rong XZ.An experimental study on systemic inflammatory response syndrome induced by subeschar tissue fluid［J］.Burns，2000，26(2):149－155.

［7］方亦兵，肖政辉，祝益民，等.血浆 TNF－α、D－乳酸与危重病例评分的相关性分析［J］.中国医师杂志，2003，5(7):898－901.

［8］Sheron N，Williams R.IL－8 as a circulating cytokine:induction by recombinant tumor necrosis factor alpha ［J］.Clin Exp Immunol，1992，89(1):100－103.

［9］Ogawa M.Acute pancreatitis and cytokines: “second attack”by septic complication leads to organ failure［J］.Pancreas，1998，16(3):312－316.