人胆固醇酯水解酶真核表达载体的构建及U937细胞系的转染

顾立学，罗俊生，王 瑞，冯 旭，关 宁，霍晓川

(辽宁医学院附属第一医院，辽宁 锦州 121001)

缺血性脑血管病(ICVD)的主要病理基础是脑供血血管的动脉粥样硬化(AS)性狭窄［1］。AS斑块的显著特征是脂质在巨噬细胞中蓄积形成泡沫细胞［2］。如何抑制AS的形成及发展是防治ICVD的重要研究方向。人胆固醇酯水解酶(hCEH)主要作用是催化胆固醇酯(CEs)水解为游离胆固醇(FC)，从而促进胆固醇外流，减少CEs在细胞内蓄积，从而减少泡沫细胞形成。研究发现hCEH的表达水平与AS的易感性呈负相关［3］。可见，hCEH在AS的形成过程中起到关键性作用。2009年12月～2010年10月，我们构建了hCEH绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-N1-hCEH，通过转染单核巨噬细胞，可以特异性上调其pEGFP-N1-hCEH表达，为进一步研究hCEH的功能奠定基础。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料 人肝细胞L-O2(北京酶阿查生物控股有限公司)，Trizol Reagent(Invitrogen公司)，E.coli DH5α、pMD19-T 克隆载体试剂盒、限制性内切酶 EcoRⅠ和 SalⅠ、RNA PCR Kit ver.3.0 反转录试剂盒、DNA Ladder Marker(TaKaRa公司)，凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒(Axygenbio公司)，FUGENE HD转染试剂(罗氏公司)。真核表达载体pEGFP-N1、人单核巨噬细胞株U937(辽宁医学院科学实验中心实验室)。

1.2 实验方法

1.2.1 RNA提取及cDNA扩增 根据GenBank公布的hCEH基因［AC:AY268104编码区序列设计引物(由大连TakaRa公司合成)］。上游引物序列:5＇-GTCAGAATTCACCATGTGGCTCCGTGCCTTTATC-3＇(内含EcoRI位点GAATTC、Kozac序列ACC和起始密码子 ATG;下游引物序列:5＇-TGTAGTCGACCACAGCTCTATGTGTTCTGTCTGG-3＇(内含 SalⅠ位点GTCGAC，为实现基因与表达载体的融合表达，终止密码子由TGA突变为TGG)。

采用Trizol一步法从L-O2中提取总RNA。测定浓度，并根据A260/A280分析RNA样品纯度。10g/L琼脂糖凝胶电泳检测RNA样品的完整性。用提取的总RNA反转录合成cDNA，行PCR，反应产物回收、纯化后，取5 μl用1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.2 T-A克隆及pEGFP-N1-hCEH的构建 ①T载体连接及测序:将回收纯化的 PCR产物与pMD19-T载体连接，命名为pMD19-T-hCEH，并将其转化至DH5α感受态细胞，利用蓝白斑现象，选取白色菌落进行阳性鉴定。用Axyprep质粒提取试剂盒提取质粒，限制性内切酶EcoRⅠ和 SalⅠ双酶切鉴定。阳性质粒送大连TakaRa公司测序。②pEGFPN1-hCEH的构建:用限制性内切酶EcoRⅠ和 SalⅠ分别切割pEGFP-N1和pMD19-T-hCEH，37℃过夜。1%琼脂糖凝胶电泳，凝胶回收纯化。T4连接酶将酶切回收的pEGFP-N1和hCEH连接，22℃连接过夜。连接产物转化到DH5α感受态细胞内，挑取单菌落扩大培养后提取重组体质粒进行双酶切鉴定，阳性质粒命名为pEGFP-N1-hCEH，送大连TakaRa公司测序。

1.2.3 U937培养及基因转染 取在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中悬浮生长的U937，置于5%CO2、37℃的细胞培养箱中培养。实验前1 d将U937接种于6孔板内。当细胞密度达80% ～90%后，按照FUGENE HD转染试剂说明书方法进行转染(转染组)。同时设立转染空质粒pEGFP-N1对照组(对照组)和未转染的正常细胞组(正常组)。转染72 h后，用荧光倒置显微镜观察细胞中绿色荧光蛋白表达情况，96 h后加G418(500 μg/ml)进行阳性细胞筛选，挑单克隆扩大培养，同时用G418(250 μg/ml)维持培养。

2 结果

2.1 L-O2中总RNA的提取及hCEH基因获取结果 1%琼脂糖凝胶电泳条带显示28 S、18 S和5 S蛋白条带，28 S是18 S的两倍，条带清晰，提示总RNA提取完整。PCR扩增后获得约1700 bp的蛋白条带，与hCEH基因(1704 bp)基本一致。条带清晰、特异(说明T-A克隆成功)。

2.2 pEGFP-N1-hCEH的构建及鉴定结果pMD19-T-hCEH重组质粒经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切后，回收目的片段亚克隆至表达载体 pEGFP-N1(4700 bp)，转化后提取的重组表达质粒经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切，获得2条与hCEH编码基因片段及pEGFP-N1载体相对应的条带(1700、4700 bp)。

测序结果证明扩增的目的片段与GenBank中hCEH的基因序列完全一致。该基因序列用Primer5.0翻译成氨基酸序列后，与GenBank中的氨基酸序列完全相同，说明pEGFP-N1-hCEH构建成功。

2.3 pEGFP-N1-hCEH 转染 U937后 pEGFP-N1-hCEH的表达 转染组48 h后，部分细胞发出绿色荧光，但荧光微弱，96 h后荧光细胞数目最多，荧光最强。G418筛选到14 d，出现细胞的单克隆团，荧光显微镜下观察转染细胞发出绿色荧光较弱。对照组48 h后，荧光相对较强，随后荧光细胞数目增多，96 h后荧光明显增强。G418筛选14 d后出现单克隆团，荧光较强。正常组无荧光表达。

3 讨论

CEs在巨噬细胞内蓄积是AS发展过程中最早发生的普遍事件之一［4］。CEs与脂蛋白质一起在内含体或溶酶体内被水解为FC，后者转运和聚集到血浆膜。过量的膜胆固醇和部分低密度脂蛋白(LDL)衍生的FC被转运到内质网，在内质网被脂酰辅酶A-胆固醇酰基转移酶1(ACAT1)重新酯化，储存在胞质脂质小滴中［5］。导致CEs在细胞内蓄积，泡沫细胞形成。细胞外受体介导的胆固醇外流是去除细胞内胆固醇的主要机制，对防止泡沫细胞的形成和AS病变的发展起关键作用［6］。然而，为了使其能外流，FC首先必须通过中性CEH介导的水解作用从储存的CEs中释放出来［7］。

本实验以GenBank公布的hCEH的编码序列为模板设计引物，提取L-O2中总RNA，经TR-PCR扩增获取目的基因，并构建其真核表达载体pEGFPN1-hCEH，通过酶切鉴定、菌液PCR和DNA序列测定证实:获取的片段为hCEH目的基因，pEGFP-N1-hCEH构建成功。并进一步将pEGFP-N1-hCEH转染U937，转染细胞发出较强的绿色荧光，证明hCEH在细胞内表达。

研究发现CEH的表达水平与AS的易感性呈负相关，AS斑块的消退与胆固醇逆行转运(RCT)密切相关。巨噬细胞内的FC通过细胞外胆固醇受体被传送到肝脏转变成胆汁胆固醇和胆汁酸最终被清除，这种FC从巨噬细胞定向转运到肝脏的过程被称为RCT，是胆固醇向体外代谢的主要途径［8］，而CEH介导的水解作用是RCT中的限速步骤［9］。近期研究表明，CEH在肝脏内的过表达能促进胆固醇逆行转运，增强体内胆固醇的清除。因此，CEH在AS的形成过程中可能起到关键性的作用。pEGFPN1-hCEH的成功构建，为hCEH与AS相关性的研究提供工具。稳定转染U937模型的建立，对研究hCEH对胆固醇代谢机理的研究具有重要意义。

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