EGF对脑胶质瘤U251细胞增殖的影响及意义

(1河北大学医学部，河北保定 071000;2河北大学图书馆;3河北大学预防与卫生管理系)

脑胶质瘤是颅内最常见的肿瘤，表皮生长因子受体(EGFR)信号传导通路参与调节大多数肿瘤的发生、发展过程。EGF是EGFR的配体，EGF对胶质瘤的影响机制并不十分清楚。2010年6～8月，我们观察不同浓度的EGF对人脑胶质瘤细胞U251增值能力的影响，探讨EGF在细胞信号传导通路中的作用。

1 材料与方法

1.1 细胞及主要试剂 胶质瘤细胞株U251为本校实验室冻存。EGF(Sigma公司)溶解于二甲基亚砜(DMSO)中配制成1 000 ng/ml母液，分装后－86℃保存。实验前用新鲜DMEM(Gibco公司)培养液按比例稀释至终浓度，冰上避光操作。MTT(Sigma公司)，鼠抗人Ki-67单克隆抗体及免疫组化其他试剂(福州迈新生物有限公司)。

1.2 细胞培养及分组 U251用含10%小牛血清的DMEM高糖培养基，37℃、5%CO2孵箱培养，培养液加1%双抗(青霉素、链霉素)，0.25%胰酶消化传代。

取对数生长期的细胞用无血清培养基培养6 h，再用含10%小牛血清的DMEM 培养液调整细胞浓度为 1 ×104，接种于96 孔板上，每孔180 μl，设空白对照孔。分别加入10、50、100、200 ng/ml的EGF作用24 h(实验组)，以不加EGF的细胞为对照组。各设5个复孔，37℃、5%CO2、饱和湿度的条件下培养。

1.3 观测指标及方法 ①U251形态:采用倒置显微镜观察。②细胞增殖力:采用MTT法检测U251细胞增殖力。酶标仪设570 nm为检测波长，测各孔的吸光度值(A值)。③U251中 Ki-67:取对数生长期细胞滴加在多聚赖氨酸处理的无菌载玻片上，细胞爬满载玻片后经冷丙酮固定15 min，采用免疫组织化SP法检测细胞中Ki-67。以细胞核呈棕黄或棕褐色为阳性细胞，在高倍镜(400×)下随机选取10个视野，以阳性染色的细胞数与所测细胞数的比为增殖指数(PI)［1］。

1.4 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件。计量资料用±s表示，采用方差分析，计数资料用χ2检验。α =0.05。

2 结果

2.1 U251的形态学改变 与对照组比较，实验组贴壁瘤细胞数量明显增加，排列密集，不同剂量的EGF能够促进细胞生长。

2.2 两组细胞增殖力比较 与对照组比较，实验组中加入10、50、100、200 ng/ml EGF的细胞A值随着EGF浓度的提高而增加，100 ng/ml时A值最高，呈剂量—效应关系(P＜0.05);与加入100 ng/ml EGF的细胞A值比较，加入200 ng/ml EGF的细胞A值下降(P＜0.05)。详见图1。

图1 不同浓度EGF对U251细胞增殖的影响

2.3 两组U251中Ki-67 PI比较 对照组Ki-67 PI为16.2 ±1.9;实验组中，加入10、50、100、200 ng/ml EGF 的细胞中 Ki-67 PI分别为 23.1 ±1.7、33.9 ±2.8、46.0 ±3.2、20.4 ±1.5。100 ng/ml的 EGF 作用下U251中Ki-67 PI为最高(P＜0.05)。

3 讨论

EGF介导的细胞信号传导通路对肿瘤细胞活性的影响是目前的研究热点之一。EGF能够促进细胞增殖，并在细胞分化、新生血管形成方面起一定作用。EGF与EGFR结合后，引起质膜或胞内酪氨酸残基特异蛋白激酶从失活转变为活性形式，磷酸化EGFR(p-EGFR)是EGFR活化形式。可激活下游的多种细胞信号传导通路而促进细胞增殖，调控细胞的生物学活性。

本研究发现，在加入一定浓度的外源性EGF(10～100 ng/ml)后，U251 A值随EGF浓度的增加而增加，表明一定剂量的EGF可以促进U251细胞增殖。与对照组比较，实验组贴壁瘤细胞数量明显增加，排列密集，从形态学上支持了一定剂量EGF的促细胞增殖效应，提示小剂量EGF有促进U251细胞增殖的作用。分析原因这可能与EGF介导的细胞信号传导通路被活化从而促进了U251生长有关。

细胞增殖率与肿瘤生长、侵袭能力密切相关，因此检测肿瘤增殖活性对肿瘤生物学行为判断具有重要意义［2］。Ki-67是一种与细胞有丝分裂密切相关的抗原，与细胞增殖有着密切的关系，其基因定位在10号染色体上。作为细胞与细胞周期密切相关的细胞核蛋白，Ki-67是目前认为最重要的细胞增殖标记物［3，4］。本实验结果显示，与对照组比较，实验组随EGF剂量的增加(10～100 ng/ml)，U251中Ki-67 PI增加，Ki-67表达上调，呈剂量依赖性，说明随着EGF的剂量增加U251细胞增殖潜能也在不断地增加。

我们还发现，当EGF增加至200 ng/ml时，实验组A值下降，PI也下降，提示高浓度EGF对U251促增殖作用减弱，说明EGF能够双向调节U251的生物学活性。这与EGF对GL15细胞增殖的影响一致［5］。分析原因可能与EGF的受体消耗以及细胞自身的负反馈有关，提示我们高浓度EGF对U251的生长抑制作用可为临床治疗胶质瘤提供另一条思路。

总之，一定浓度范围内的EGF可促进U251细胞增殖，EGF可以双向调节U251的生物学活性，在细胞信号传导通路中发挥重要作用。

［1］崔勇，王洪，方川，等 .人脑胶质瘤组织中EGFR、MMP-9、Ki67的表达及意义［J］.山东医药，2010，50(38):77-78.

［2］Scholzen T，Gerdes J.The Ki-67 protein:from the known and the unknown［J］.J Cell Physiol，2000，182(3):311-322.

［3］DuchrowM，Gerdes J，Schluter C.The proliferation associated Ki67 protein:definition inmolecular terms［J］.Cell Prolif，1994，27(5):235-242.

［4］Nakano T，Oka K.Differential values of Ki-67 index andmitotic index of proliferating cell population:an assessment of cell cycleand prognosis in radiation therapy for cervical cancer［J］.Cancer，1993，72(8):2401-2408.

［5］席桂发，王宝峰，王和平，等.EGF和AG1478对GL15细胞增殖、侵袭和GFAP表达的影响［J］.中华神经外科疾病研究杂志，2007，6(4):302-304.