微波制备IFN－γ处理的小鼠H22肝细胞疫苗免疫对小鼠腹腔巨噬细胞功能的影响

杨晓峰，杨新宏，朱艳菊，丁晓旭，李晓明，孙立新

(承德医学院附属医院，河北承德067000)

单核巨噬细胞系统是机体保持内环境稳定的一个最重要系统，广泛参与免疫应答、免疫效应和免疫调节。巨噬细胞的功能是衡量机体免疫水平的一项重要标志，为机体免疫清除突变细胞的重要因素。2007年9月，我们根据IFN－γ可促进MHC－I类抗原表达，微波修复抗原可提高病理组织的抗原性原理，应用IFN－γ和微波制备全细胞瘤苗，观察了此瘤苗对巨噬细胞功能的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 BALB/C小鼠，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，体质量14～16 g，8周龄，正常饲养。肝癌细胞H22瘤株:由白求恩医科大学提供，液氮冻存。使用时复苏细胞，接种于含10%胎牛血清(FBS)的1640培养基，培养至对数生长期 ，接种于BALB/C小鼠腹腔传代。

1.2 H22肝癌细胞疫苗(MITTV－H22)及 H22细胞抗原的制备 ①MITTV－H22制备。收集 BALB/C小鼠腹水H22肿瘤细胞，1640培养液洗2遍，常规培养，并加入 IFN－γ(200 U/ml)，培养 48 h［1］。收集H22细胞，生理盐水洗2遍，制成2.5×106/ml的细胞悬液，微波照射20 s(750 W、2450兆赫)，制成MITTV－H22，4℃储存备用。经台盼蓝染色镜下观察证实肿瘤细胞已全部灭活。②H22细胞抗原制备。收集H22细胞，生理盐水洗2遍，调至1×107/ml，将细胞悬液置－80℃冷冻，37℃水浴溶解，反复冻融4次。13 000 r/min、离心60min，吸取上清，过滤除菌，分装，－80℃保存备用。

1.3 实验分组与动物模型制备 小鼠检疫10 d后随机分组。实验组右后肢外侧皮下接种MITTVH22悬液0.2 ml，每周免疫1次，共3次;对照组用生理盐水代替MITTV－H22。末次免疫后第7天处死小鼠，腹腔内注入预冷的Hank's液5 ml/只，轻轻按揉腹部，以充分洗出腹腔巨噬细胞;将腹壁剪开一个小口，吸取腹腔灌洗液收集腹腔巨噬细胞，进行后续实验。各组在同等条件下饲养，均自由饮食。

1.4 巨噬细胞表面分子MHC－Ⅱ表达水平测定［2］腹腔巨噬细胞与H22抗原(1∶10)37℃、5%CO2共培养18 h。收集巨噬细胞PBS洗3次后弃上清，加入MHC－Ⅱ荧光抗体，4℃暗室孵育30min，加入PBS 500 μl，流式细胞仪检测荧光强度。

1.5 吞噬率计算 吸取0.5 ml含0.5%鸡红细胞的巨噬细胞悬液，加入玻片上，37℃孵育15～20min。迅速用生理盐水冲掉未贴壁细胞，吉姆萨染色，镜下计数吞噬率。吞噬率(%)=(吞噬红细胞的巨噬细胞数/巨噬细胞总数)×100%。

1.6 细胞周期测定 将腹腔巨噬细胞与H22抗原(1∶10)37℃、5%CO2共培养18 h。同时常规制备MITTV－H22免疫小鼠脾淋巴细胞悬液，与巨噬细胞(经H22抗原处理18 h)共孵育(24孔板，脾淋巴细胞1×107/孔，巨噬细胞1×104/孔)24 h。收集悬浮的脾淋巴细胞，PBS洗3遍，弃上清，调为1×107/ml细胞悬液，取 100 μl加入 Hamster anti mouse CD69－PE抗体，室温避光30min，加入500 μl PBS混匀，FACS检测脾细胞表面抗原CD69分子。同时另取脾淋巴细胞悬液［3，4］，PBS 洗 3 遍，75%乙醇固定过夜。PBS洗 3次，弃上清，剩余 50 μl细胞悬液，加入RNase A(1 mg/ml)100 μl，37 ℃ 孵育 30min，加入PI(0.5 mg/ml)50 μl，PBS 800 μl，室温避光 30min，流式细胞仪测定细胞周期。

1.7 统计学方法 应用SPSS15.0统计软件，行两独立样本t检验，P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 腹腔巨噬细胞表面分子MHC－Ⅱ表达率 实验组与对照组巨噬细胞表面分子MHC－Ⅱ的表达率分别为 85.95% ± 1.50%、62.71% ± 1.86%，P=0.000(t=30.808)。

2.2 巨噬细胞吞噬率 实验组与对照组巨噬细胞吞噬率分别为 35.30% ±9.79%、15.00% ±6.63%，P=0.000(t=5.429)。

2.3 脾淋巴细胞表面CD69表达 实验组与对照组脾淋巴细胞表面 CD69表达率分别为11.96% ±4.20%、5.94% ±1.41%，P=0.016(t=3.038)。

2.4 细胞周期 实验组与对照组S+G2－M期脾淋巴细胞所占比例分别为51.17% ±3.11%、31.56%±2.59%，P=0.000(t=9.684)。

3 讨论

MHC－Ⅰ类分子表达于所有有核细胞，而肿瘤往往表达明显减少或丢失，不能引起有效的杀肿瘤效应［5］，从而逃避宿主的免疫攻击。肿瘤细胞表面“抗原覆盖”或“抗原遮蔽”是肿瘤细胞逃避免疫攻击的另一因素。抗原覆盖是指肿瘤细胞表面抗原可能被某些物质所覆盖，如肿瘤细胞可表达高水平的唾液黏多糖或表达肿瘤激活的凝聚系统，均可覆盖肿瘤抗原。肿瘤抗原可经糖基化等方式隐藏，这一过程称为抗原遮蔽。可致肿瘤抗原不能被宿主的淋巴细胞所识别，不能有效地被杀伤。IFN是调节MHC－Ⅰ类抗原表达的一个重要生物因子［6］。IFN－1、IFN－2均可引起MHC－Ⅰ类抗原表达增高，但IFN－γ的作用更强。微波作为抗原修复的方法已广泛用于免疫组织化学染色的抗原暴露，是最敏感的抗原修复方法，其可使病理切片的抗原更充分暴露，提高免疫组化染色的敏感性。小鼠H22肝癌细胞株肿瘤抗原性弱，MHC－Ⅰ表达缺失。基于IFN－γ的上调MHC－Ⅰ和微波暴露抗原的原理，我们用IFN－γ和微波共同处理H22肿瘤细胞，制备MITTV－H22瘤苗，既消灭了其致瘤性又增加了其表面MHC－Ⅰ及抗原的表达，可提高其抗原呈递能力和抗原性。

在机体的免疫系统中，巨噬细胞由于其活跃的生物学功能，尤其是在免疫应答和机体防御机制中的作用而一直受到重视，是肿瘤生物学疗法中的重要应答和调动环节之一［7］，其担负着吞噬细菌、提呈抗原、启动特异性免疫应答、抗肿瘤并参与免疫调节等作用［8］。巨噬细胞直接吞噬肿瘤细胞，显示出非特异性杀瘤作用，同时巨噬细胞作为抗原提呈细胞，将摄入的肿瘤细胞消化、加工，并将特异性抗原以MHC限制的形式递呈给T淋巴细胞，从而参与特异性肿瘤免疫［9，10］。巨噬细胞的吞噬功能有利于其清除肿瘤，亦是其加工处理抗原的前提。本研究结果显示，MITTV－H22瘤苗免疫小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能增强，有利于巨噬细胞功能的发挥。巨噬细胞表面MHC－Ⅱ类分子的表达是抗原提呈的分子基础，本实验MITTV－H22瘤苗免疫小鼠腹腔巨噬细胞MHC－Ⅱ类分子表达增强，有利于其抗原提呈功能的发挥。因巨噬细胞活化淋巴细胞的能力是其抗原提呈功能实现的具体表现，故淋巴细胞增殖表达的CD69等活化分子，可以作为淋巴细胞活化的标志。

T细胞活化后表达数个膜表面分子，包括CD69、IL－2受体CD25、转铁蛋白受体CD71，被称为活化标志。CD69是其中表达最早的一个，刺激后1～2 h即可在T细胞表面发现并迅速达到高峰，表达可持续72 h［11］。静止状态的T细胞不表达CD69，但当T细胞受刺激活化后可诱导性表达CD69。T细胞表面CD69与其单克隆抗体结合可引发细胞外Ca2+的内流，细胞内 TNF、IFN－γ 等细胞因子分泌，IL－2 及其受体合成与表达，增强转录因子AP－1的活性，并通过细胞内信号传导增强T细胞的增殖;因此其被认为是一个T细胞增殖的共刺激信号。本研究MITTV－H22瘤苗免疫后小鼠腹腔巨噬细胞诱导淋巴细胞表达CD69增多，表明活化淋巴细胞的能力增强。

细胞周期反映细胞增殖过程，按其染色体行为而人为分为 G1期(DNA合成前期 )、S期(DNA合成期)、G2期(DNA合成后期)、M期(有丝分裂期)，细胞经上述四期而完成其增殖，其中暂时脱离细胞周期不进行细胞增殖的细胞称为G0细胞。通过流式细胞术检测细胞DNA含量可将细胞分为G0/G1期(DNA为二倍体)、G2/M期(DNA为四倍体)和S期(DNA介于二者之间)。S期和G2/M期细胞均为增殖期细胞，其细胞比例可反映细胞的增殖活性。本实验结果显示，MITTV－H22瘤苗免疫小鼠其腹腔巨噬细胞可使淋巴细胞S期和G2/M期的细胞比例增加，显示淋巴细胞增殖活性增强，表明巨噬细胞活化淋巴细胞能力增强。

总之，MITTV－H22免疫小鼠，可使其腹腔巨噬细胞表面MHC－Ⅱ类分子的表达升高，吞噬活性明显增强，诱导脾淋巴细胞表面分子CD69表达增高并使脾淋巴细胞G2/M期和S期的比例升高。提示MITTV－H22瘤苗免疫接种可提高巨噬细胞的功能，使其更好地在抗肿瘤免疫中发挥作用。

［1］Wroblewski JM，Bixby DL，Borowski C，et al.Characterization of human non－small cell lung cancer(NSCLC)cell lines for expression of MHC，co－stimulatory molecules and tumor－associated antigens［J］.Lung cancer，2001，3(2－3):181－194.

［2］刘艳君，田野苹，曹雪涛.巨噬细胞在MIF基因修饰瘤苗诱导小鼠抗肿瘤免疫中的作用［J］.中国肿瘤生物治疗杂志，2000，7(1):35－38.

［3］石艳春，郑源强，杨贵贞.CpGODN对 rHBsAg免疫小鼠脾细胞周期与凋亡的影响［J］.中国免疫学杂志，2006，22(11):1067－1070.

［4］崔自由，黄幼田，赵继敏，等.应用流式细胞术动态观测小鼠树突状细胞诱导的 T细胞增殖的变化［J］.郑州大学学报(医学版)，2005，40(5):822－824.

［5］杨镇.《肿瘤免疫学》［M］.武汉:湖北科学技术出版社，1998:39－42.

［6］D'Ursocm，Wang ZG，Cao Y，et al.Lack of HLA class I antigen expression by cultured melanoma cells FO－1 due to a defect in B2m gene expression［J］.J Clin Invest，1991，87(1):284－292.

［7］汪谦.现代医学实验方法［M］.2版.北京:人民卫生出版社，1998:770.

［8］吴瑞琼，张家华，王玉龙，等.卡介克蟹对巨噬细胞吞噬功能的调变［J］.中国免疫学杂志，1994，10(4):240－242.

［9］向连滨，向近敏，向家宇.巨噬细胞的分子生态学［J］.免疫学杂志，1994，10(1):1－3.

［10］Baek KH，Ha SJ，Sung YC.A novel function of phosphorothioate ligodeoxy nucleotides as chemoattractants for primary macrophages［J］.J Immunol，2001，167(5):2847－2851.

［11］申蓉，李丽珍.CD69与免疫功能的调节［J］.国外医学:免疫学分册，2004，27(1):24－27.