内皮细胞缺氧后miR-210、miR-92a、miR-126表达及意义

刘 芬，娄远蕾，阮琼芳，谢 安，李 勇，崔苏萍，汪 泱

(南昌大学第一附属医院，南昌330006)

研究证实，脏器缺血缺氧后可出现代偿性的血管新生;microRNA与血管新生密切相关。在生物体的生长、发育及疾病发生中起重要作用［1］。前期我们研究发现，小鼠肾缺血后可出现血管新生，且microRNA(如 miR-210、miR-92a、miR-126)出现明显改变［2］，但microRNA调控肾血管生成的机制尚不明确。2010年2～6月，我们观察了人微血管内皮细胞缺氧后血管新生相关microRNA的表达变化，旨在为microRNA调控缺血缺氧后血管生成机制的研究提供依据。

1 材料和方法

1.1 材料 实验细胞:人微血管内皮HMEC细胞:购自长沙赢润生物技术有限公司。主要试剂及仪器:Trizol Reagent(美国Invitrogen公司);逆转录试剂盒(美国Promega公司);核酸和蛋白分析仪(美国Bekman公司)，ABI 7500实时定量 PCR系统(ABI，美国)，CO2孵箱(美国热电公司)，低氧培养箱(日本三洋公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞缺氧模型制作 将1×106个/ml的HMEC细胞接种于含20%FBS和EGF(10 ng/ml)M199培养液的培养瓶中，置于37℃、5%CO2孵箱中培养，隔天换液。待细胞贴壁生长、增殖至约80%融合时，0.25%EDTA胰蛋白酶消化传代。更换不含血清及EGF的M199培养液后分为两组。缺氧组置于37℃低氧培养箱，通入5%CO2、94%N、1%O2混合气体，低氧培养6 h;对照组置于5%CO2孵箱中培养。

1.2.2 观察项目 ①细胞形态:于光学倒置显微镜下观察两组细胞形态学变化并照相。②细胞miR-210、miR-92a、miR-126表达:采用实时定量PCR法。收集细胞，采用Trizol法抽提总RNA，核酸测定仪测A260/A280(要求为 1.8 ～2.0)，1% 琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA质量。采用stem-loop引物行miR-210、miR-92a、miR-126 逆转录［3］，反应条件:16 ℃、30min;30 ℃、30 s，42 ℃、30 s，50 ℃、1 s，共 60 个循环;70℃、15min。以U6为内参，采用SYBR GreenI qPCR方法进行扩增，检测系统为ABI 7500 real time PCR system，反应条件:95 ℃、10min，95 ℃、15 s，60℃、30 s，40个循环。最后行融解曲线分析。每个样本设3个重复管，同时设无模板阴性对照。基因表达的相对变化以2－△△Ct表示。实验重复3次。

1.3 统计学方法 采用SPSS11.0软件行统计学处理，计量数据资料用±s表示。组间差异比较采用小样本t检验，P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞形态 与对照组比较，缺氧组细胞增殖变慢，细胞内颗粒增多，贴壁细胞减少，悬浮细胞增多。

2.2 miR-210、miR-92a、miR-126 表达 与对照组比较，观察组 miR-210、miR-92a、miR-126分别上调了(5.19 ±0.99)、(3.02 ±0.88)、(3.87 ±0.83)倍，P 均 ＜0.05。

3 讨论

microRNAs是一组21-25 nt长的非编码蛋白质的短序列RNA，能通过碱基配对与mRNA分子的3'非翻译区相结合，降解mRNA或抑制靶基因的翻译，从而对基因进行转录后表达的调控。近年来研究发现，microRNA能够通过调控与内皮细胞功能相关基因的表达参与内皮细胞和血管功能的调节;尤其是一些血管内皮细胞特异性和高表达的microRNA，在血管的病理生理过程中发挥着重要的调控功能。文献报道，过表达miR-92a于正常脐静脉内皮细胞上可阻断血管出芽，抑制血管网形成及内皮细胞迁移［4，5］。Wang等［6］发现，抑制糖尿病大鼠来源的微血管内皮miRNA-320表达可促进血管内皮增殖和迁移。当大鼠miR-126缺失时，其血管完整性破坏和内皮细胞增殖、迁移及血管生成缺陷，将导致血管渗漏、出血及部分胚胎致死，而存活的miR-126缺失大鼠在心梗时也出现血管新生缺陷［7］。

血管内皮细胞是覆衬于全身血管和淋巴管内面的单层扁平细胞，在维持血管完整性、血管新生及创伤愈合中起重要作用，也是最先感受缺氧的细胞之一。研究证实，缺血脏器组织内皮特异性microRNA如 miR-210、miR-92a、miR-126 表达升高［7，8］。本研究证实HMEC细胞缺氧后内皮特异性 miR-210、miR-92a、miR-126均明显上调;提示缺氧可促进内皮特异性microRNA表达改变，此可能为缺氧后血管新生的机制。

Fish等［9］研究证实，miR-126是通过负调控其靶基因Spred1和磷酸激酶-3调节亚基2(PIK3R2/p85-beta)从而促进血管新生的;而 Spred1和PIK3R2是VEGF信号通路的负调控因子。有报道，miR-210可通过促红细胞生成产生肝细胞受体/ephrin配体，而Eph/ephrin信号通路介导血管内皮生长因子(VEGF)调控血管新生［10］。我们前期的体内实验亦已证实，肾缺血性损伤后可出现代偿性血管新生，缺氧可诱导miRNA-92a、miRNA-210表达上调，与血管新生相关的信号分子VEGF表达亦升高。结合生物学分析推测，miRNA-210、miRNA-92a均可直接或间接靶向VEGF，miRNA/VEGF-Notch1可能是肾缺血性损伤后血管新生的主要调控通路［11］。

综上所述，缺氧可促使内皮细胞特异性microRNA表达改变;此可能为缺氧后血管新生的调控机制。关于缺氧后内皮特异性microRNA与血管新生相关信号分子表达的变化有待于进一步阐明。

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