分子标记技术在棉花育种中的应用

赵兴华，渠云芳，黄晋玲

（山西农业大学农学院，山西太谷030801）

与其他农作物相比，棉花的基因组学及利用分子标记技术进行棉花育种改良等方面的研究比较落后。近30 a来，随着分子生物学和生物信息学的迅速发展，使得建立在DNA水平上的、以揭示棉花遗传的分子标记技术研究成为可能。

分子标记是以DNA分子碱基序列的变异为基础，所揭示的多态性直接反映基因组DNA间的差异。与形态学标记、细胞学标记和生化标记相比，分子标记具有准确度高、数量多、多态性高、共显性好、对表型无影响、检测手段简单快捷以及开发和使用成本低等优越性。因此，分子标记技术以其自身的优越性在棉花遗传图谱构建、分子标记辅助选择育种、重要农艺性状基因的标记定位、种质资源的遗传多样性分析和纯度鉴定等方面具有重要的应用价值[1]。

本文对棉花上应用的几种分子标记技术以及它们在棉花育种中的应用与展望进行了阐述。

1 分子标记的类型

分子标记根据其产生的特点，大致可分为4类[2]：第一类，以DNA—DNA杂交技术为基础，如限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP），数目可变串联重复序列多态性（Variable Numberof Tandem Repeat，VNTR）。第二类，以PCR技术为基础，如随机扩增片段长度多态性DNA（Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD），简单重复序列（Simple Sequence Repeat，SSR），序列特异性扩增片段（Sequence-Characterized Amplified Region，SCAR），相关序列扩增多态性（sequence-related amplified polymorphism，SRAP），靶位区域扩增多态性（target region amplified polymorphism，TRAP），扩增片段长度多态性（Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP）。第三类，以DNA单链、单核苷酸多态性为基础，如单链物质多态性（Single Strand Conformation Polymorphism，SSCP）、单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP），衍生的酶切扩增多态性（derived Cleaved Amplified Polymorphic Sequence，dCAPS）。第四类，原位杂交技术（In Situ Hybridization，ISH），包括荧光原位杂交（Fluorecence In Situ Hybridization，FISH）和基因组原位杂交（Genome In Situ Hybridization，GISH）等。

2 几种分子标记的原理及特点

2.1 简单重复序列（SSR）

简单重复序列也称微卫星DNA，其串联重复的核心序列为1～6 bp。其中，在农作物中最常见的二核苷酸重复单位是（AC）n和（GA）n，每个微卫星DNA的核心序列结构相同，重复单位数目10～60个，其高度多态性主要来源于串联数目的不同。SSR标记的基本原理：根据微卫星序列两端互补序列设计引物，通过PCR反应扩增微卫星片段，由于核心序列串联重复数目不同，因而能够用PCR的方法扩增出不同长度的PCR产物，将扩增产物进行凝胶电泳分析核心序列的长度多态性。

与其他分子标记相比，SSR标记具有的优点[3-4]为：（1）所需 DNA 量少；（2）覆盖整个基因组，多态性高；（3）具有多等位基因的特性；（4）呈共显性遗传。缺点是：在采用SSR技术分析微卫星DNA多态性时，必须知道重复序列两端的DNA序列的信息，如不能直接从DNA数据库查寻获得，则首先必须对其进行测序。

2.2 相关序列扩增多态性（SRAP）和靶位区域扩增多态性（TRAP）

相关序列扩增多态性和靶位区域扩增多态性是基于PCR标记最近发展起来的新型分子标记系统。其中，SRAP由Li等[5]于2001年提出，又叫基于序列扩增多态性（sequence-based amplified polymorphism，SBAP）[6]。该标记通过独特的双引物设计，对基因的 ORFs（Open reading frames）的特定区域进行扩增，上游引物对外显子区域进行特异扩增，下游引物对内含子区域、启动子区域进行特异扩增，因不同个体以及物种的内含子、启动子与间隔区长度不同而产生多态性。

TRAP由Hu等[7]于2003年提出，其技术是从SRAP技术改进而来的。SRAP使用2个任意引物；而TRAP是使用长度为16～20 bp核苷的固定引物与任意引物，固定引物以公用数据库中的靶EST序列设计而来，任意引物与SRAP所用的一样，为一段以富含AT或GC为核心、可与内含子或外显子区域配对的随机序列[8]。SRAP和TRAP分子标记都可检测基因的可译框（ORFs）区域，但引物设计是SRAP与TRAP分析的关键，SRAP标记技术无须任何序列信息，而TRAP技术需要基于已知cDNA或EST序列信息设计固定引物才可进行PCR扩增。

2.3 扩增片段长度多态性（AFLP）

扩增片段长度多态性是1993年荷兰科学家Zebeau Mare等[9-10]发展起来的一种新的分子标记技术。AFLP是RFLP与PCR相结合的产物，其基本原理是：先利用限制性内切酶水解基因组DNA产生不同大小的DNA片段；再使双链人工接头的酶切片段相连接，作为扩增反应的模板DNA；然后以人工接头的互补链为引物进行预扩增；最后在接头互补链的基础上添加1～3个选择性核苷酸作引物，对模板DNA基因再进行选择性扩增，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离DNA扩增片段，根据扩增片段长度的不同检测多态性。

AFLP结合了RFLP和RAPD这2种技术的优点，分辨率高、稳定性好、效率高。但它的技术费用昂贵，对DNA的纯度和内切酶的质量要求较高，并且AFLP分析需要同位素或非同位素标记引物，在具有放射性同位素操作过程中，必须具备特殊的防护措施以及配套的仪器设备。

2.4 单核苷酸多态性（SNP）

单核苷酸多态性是指同一位点的不同等位基因之间仅有个别核苷酸的差异或只有小的插入、缺失等，是近年来提出的第3代DNA分子标记。SNP的最佳检测方法是DNA芯片技术，随着DNA芯片技术的发展，其有望成为最重要、最有效的分子标记技术。

3 分子标记技术在棉花育种中的应用

3.1 群体结构、亲缘关系分析及分类学研究

棉花在长期的自然选择和人工选择过程中，形成了不同的种群和品系，基因频率也发生了不同程度的分化，有时根据表型差异很难区分它们之间的亲缘关系。而DNA分子标记技术可作为测定基因频率变化的有效手段，主要通过DNA的扩增条带计算遗传相似程度，进而研究棉花的种群亲缘关系。聂以春等[11]选用80个随机引物，对栽培种陆地棉、野生种雷蒙德氏棉以及它们的杂种1代和回交后代中选育得到的9个种质系进行了RAPD遗传相似性研究，认为29个随机引物扩增的条带具多态性，并能将2个不同棉种、F1和种质系相互间加以区别。朱美霞等[12]应用RAPD-PCR技术分析了棉花种质的亲缘关系，结果表明，海岛棉与草棉的A染色体组比较接近，而陆地棉与中棉的A染色体组相近，反映了异源四倍体与二倍体A基因组的进化关系。凌磊等[13]利用SRAP标记分析了彩色棉与白色棉的遗传差异，研究结果表明，SRAP标记可以判明彩色棉和白色棉的遗传差异，为彩色棉育种的亲本选择在分子水平上提供了一定的参考依据。棉花种群亲缘关系的确定与分类研究，对于种质资源保护和新品种选育具有十分重要的战略与现实意义。

3.2 遗传多样性研究和种质鉴定与评价

利用分子标记对棉花资源进行遗传多样性分析，可从表观遗传学深入到分子水平对它们进行研究和鉴定，以避免同种异名或同名异种的麻烦，发现新种质，保护濒危种质，扩大基因资源库，丰富育成品种的遗传背景。陈光等[14]对不同亲本来源、不同选育时期、不同种植生态区的43份陆地棉基础种质进行了遗传多样性的SSR分子标记分析，研究结果显示，与早期基础种质资源相比，现代我国棉花基础种质资源的遗传多样性呈下降趋势，其中，黄河、长江主产棉区基础种质的遗传多样性还没有超过国外基础种质，且品种间的遗传背景较为狭窄。苗培明等[15]应用TRAP分子标记方法对65份棉花种质资源进行遗传多样性分析，所获得的聚类结果与种质资源的地域来源和形态特征有一定的相关性，说明TRAP分子标记方法在棉花种质资源鉴定、分类等方面的研究上具有良好的应用前景。

因此，必须采用多种途径来丰富我国棉花种质资源的遗传多样性，而通过远缘杂交导入外源遗传物质，是改良棉花遗传基础狭窄的一条重要途径。但在引入外源染色体的同时，既有对作物改良有利的基因，也存在着大量的对作物改良不利的基因，这就需要一种准确、有效的分子标记技术（如 RFLP，RAPD，AFLP和 SSR 等）对其进行种质鉴定。贺道华等[16]用均匀分布于棉花全基因组的132个SSR标记，对精选的92个棉花品种（系）进行遗传多样性分析，结果表明，此自然群体的遗传基础较为宽泛，聚类分析和系谱追溯的结果显示，该群体中品种的选育过程复杂，血统来源多样，存在较高程度的遗传多样性。郭宝生等[17]利用9对引物对46个品种或品系的DNA进行扩增，结果表明，渐渗系主要遗传背景为陆地棉，个别性状来源于海岛棉，由于渐渗位点和基因不同，从而造成一定的差异，被聚类到不同小组。

3.3 遗传图谱的构建

遗传连锁图谱是指通过遗传重组分析得到的基因在染色体上的线形排列图。高密度分子标记遗传连锁图谱的构建，可为基因定位、物理图谱构建和以图谱为基础的目的基因克隆奠定基础。到目前为止，在以RFLP，RAPD，SSR为主要分子标记技术构建的多张棉花遗传连锁图谱的基础上，林忠旭等[18]应用SRAP标记构建了棉花分子遗传连锁图，作图群体为邯郸208与Pima90杂交产生的129个F2单株，筛选出多态性较好的76个引物组合进行检测、构建连锁群。近年来，还有人运用SSR，TRAP，SRAP和AFLP标记对四倍体栽培棉进行了高密度的遗传图谱构建和纤维品质性状QTL定位，为大幅度增加棉花分子遗传连锁图的密度提供了理论基础。

3.4 QTLs的定位

目标基因是指在遗传上真实存在的特殊性状基因，如抗虫、抗病、高产、优良品质性状等基因。定位就是要把某一目标基因、质量性状和数量性状基因精确定位到染色体的具体位置上。汪保华等[19]通过对中棉所12与8891的杂交及多代自交，获得180个家系构成的重组自交系F8和F9群体，采用SSR为主的分子标记构建了遗传连锁图，并对株型性状进行了单位点和双位点水平的QTL定位。宋振云等[20]以亚红株突变体PD-17与GK19配置的BC1群体为作图群体，选用覆盖棉花所有已鉴定染色体及大多数连锁群的419对SSR引物，利用BSA（bulked segregation analysis）法筛选多态性差异引物，结果显示，位于第7条染色体上的5个分子标记与Rs基因相连锁，SSR标记BNL2634与Rs基因的遗传距离较小，约为10.3 cM，SSR标记CIR393位于Rs基因另一侧，与Rs基因的遗传距离约为29.1 cM，由此将Rs基因定位于第7染色体上。董承光等[21]对无腺体突变基因G进行了精细定位，结合棉花海陆种间遗传连锁图谱，利用SSR标记将G基因定位于 CIR362和 NAU2251b，NAU3860b，STV033之间，G基因与GIR362遗传距离为9.27 cM，与 NAU2251b，NAU3860b，STV033 的距离为0.96 cM。

3.5 品种指纹图谱的构建及品种（杂种）纯度的鉴定

指纹图谱是指能够反映生物个体间差异的电泳图谱，具有类似于人的指纹那样的高度个体特异性和稳定可靠性。各种分子标记均可用于DNA指纹图谱分析，其中，SSR和AFLP标记更为理想，所提供的多态性信息更为丰富，构建的DNA指纹图谱可以进行品种鉴定、品种真实性和纯度的检测。王俊芳[22]用SSR标记构建了85份棉花种质的指纹图谱，探讨DNA指纹图谱技术应用于棉花品种真实性和纯度检测的可能实现途径。朱云国等[23]运用AFLP同位素标记技术，获得了棉花细胞质雄性不育系、保持系、恢复系及其杂种F1的DNA指纹图谱。姜伟等[24]利用ISSR对8个新疆棉花品种（系）进行了指纹图谱构建，通过基因组多态性分析，从60条引物中筛选到11条扩增效果较好的引物，用其中2条引物UBC809，UBC841建立了8个品种的指纹图谱。

3.6 分子标记辅助育种

作物新品种的选育过程中，选择是最重要的环节之一，所谓的选择是指在一个育种群体中选择符合育种目标的基因型。传统的作物育种方式是基于作物的表现型进行选择的，具有很大的局限性。而分子标记辅助选择是在DNA水平上进行，大大缩短了育种时间，可靠而高效，加快了育种进程。柳李旺等[25]利用CMS恢复基因Rf1紧密连锁的3个SSR标记和Bt基因的PCR标记开展分子标记辅助选择，培育聚合有Rf1和Bt的转基因抗虫棉恢复系，共获得54个同时具Rf1与Bt基因的聚合单株。这些聚合单株自交后，通过标记辅助选择，获得10株含Bt基因且Rf1纯合的单株。杨泽茂等[26]利用陆地棉栽培种CCRI221（中棉45）为受体，海岛棉海1为供体，通过高代回交和分子标记辅助选择相结合的方法，构建了1个由116个家系组成的染色体片段代换系群体，利用分布在棉花基因组25个连锁群上的276个多态性标记对BC4F1进行检测，结果显示，在每个家系中代换片段最多的55个，最少的为15个，平均32.92个；覆盖了棉花基因组180.7～969.0 cM，平均覆盖502 cM。由于分子标记辅助育种不受棉花生长发育的时期及环境的影响，利用分子标记辅助育种已在棉花纤维品质育种、抗病育种等方面进行了广泛研究[27-29]。

4 结论与展望

从分子标记技术在棉花育种中的研究进展和优缺点来看，DNA分子标记技术已成为棉花分子遗传及辅助育种研究中的重要工具[30]。但是许多标记首先需要进行基因组克隆、测序、人工合成引物，开发费用相当高[31]，不能够在棉花分子育种中得到广泛的应用。

在未来的发展中，随着大规模测序技术的应用，简单快捷、稳定性好、成本低、更易于自动化的分子标记及各种标记的结合与相互转化，必将在棉花分子遗传育种的研究中发挥越来越重要的作用，并将极大地推动棉花育种的进程。

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