HPLC法测定非布索坦片的含量

北京万生药业有限责任公司（101113）辛正洪

非布索坦（febuxostat，Uloric）化学名为2-[3-氰基-4-异丁氧基苯基]-4-甲基噻唑-5-甲酸，是一种新型非嘌呤类选择性黄嘌呤氧化酶抑制剂，用于降低体内的尿酸水平，治疗由于尿酸过高引起的疾病。2009 年 2 月，FDA 批准了武田制药北美公司的非布索坦。临床疗效表现显著较别嘌呤醇好，可大幅度降低血尿酸水平，耐受性好且不良反应小，在治疗高尿酸血症及痛风上具有很大的应用前景[1]。

1 仪器与试药

Agilent1200高效液相色谱仪及其色谱工作站，TU－1901PC紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限公司），C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 µm Kromasil公司)；BP211D电子天平（赛多利斯科学仪器北京有限公司）。非布索坦对照品（北京万生药业有限责任公司，原料药精制，含量99.9%，HPLC归一法），非布索坦片（北京万生药业有限责任公司自制，40mg，批号：20101201、20101202、20101203），乙腈、甲醇为色谱纯，乙醇、甲酸、醋酸、磷酸盐为分析纯，水为二次蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件及系统适用性试验 根据文献报道非布索坦的性质[2][3]，经过甲醇、乙腈与水、磷酸盐、醋酸盐缓冲液的不同比例的筛选，最终选择色谱条件为：色谱柱：C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 µm Kromasil公司)；流动相为乙腈－0.1%甲酸（55∶45）；检测波长：317nm；流速：1ml•min-1；进样量：10µl；柱温：30℃。

测定法：精密称取非布索坦对照品10mg，置100ml量瓶中，加甲醇溶解并定容，超声使溶解，得对照品溶液。精密称取非布索坦片细粉适量（约相当于非布索坦10mg），置100ml量瓶中，加甲醇溶解并定容，超声使溶解，取续滤液为供试品溶液。分别量取两种溶液10µl，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以非布索坦峰面积计算，即得。

在上述条件下，理论板数按非布索坦计为8231。

2.2 专属性试验

2.2.1 取单位制剂量（片）空白辅料，置100ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，超声使溶解，得辅料样品溶液。取续滤液注入液相色谱仪，记录色谱图。

2.2.2 取非布索坦片细粉适量（约相当于非布索坦40mg），5份分别置100ml量瓶中。4500LX条件下放置10天，用甲醇溶解并稀释至刻度，超声使溶解，得光照破坏样品溶液；120℃条件下放置2小时，取出、放冷至室温，用甲醇溶解稀释至刻度，超声使溶解，得高温破坏样品溶液；加入1 mol•L-1氢氧化钠溶液5ml，加盖密封，于50℃水浴保温0.5小时，加入1mol•L-1的盐酸溶液5ml中和，用甲醇溶解并稀释至刻度，超声使溶解，得强碱破坏样品溶液；加入1 mol•L-1的盐酸溶液5ml，加盖密封，于50℃水浴保温0.5小时，加入1 mol•L-1氢氧化钠溶液5ml中和，用甲醇溶解并稀释至刻度，超声使溶解，得强酸破坏样品溶液；加入30%的双氧水5ml，加盖密封，于50℃水浴保温0.5小时，用甲醇溶解并稀释至刻度，超声使溶解，得强氧化剂破坏样品溶液。分别取上述溶液滤过，取续滤液注入液相色谱仪，记录色谱图。

结果显示：空白辅料产生的杂质对样品杂质测定无干扰，经光照、高温、强碱、强酸、强氧化破坏后，样品色谱图与破坏前相比，都产生了新杂质，新杂质峰与主峰能完全分离。

2.3 线性试验 精密称取非布索坦对照品20mg，置50ml量瓶中，加甲醇溶解稀释至刻度，超声溶解，为储备液。精密量取0.5、1、2、3和5ml，分别置10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。精密量取上述不同浓度溶液10µl注入液相色谱仪，记录色谱图，以浓度C为横坐标,峰面积A为纵坐标进行线性回归，方程：A=24.241C-1.3173（r=0.9996），见非布索坦浓度在20～400µg•ml-1间呈良好线性关系。

2.4 精密度试验 取非布索坦对照品溶液（100µg•ml-1）重复测定6次，记录峰面积，RSD为0.68（n=6）。

2.5 重复性 精密称取同批样品(批号20101201) 6份，按供试品溶液的制备方法操作，分别进样测定，结果非布索坦片平均含量为99.80%，RSD 为0.65% 。

2.6 回收率试验 精密称取非布索坦对照品8、10、12mg分别加至已知含量的非布索坦10mg中，每个浓度各配置3份，共9份，置200ml量瓶中，加甲醇溶解并定容，超声使溶解，得低、中、高3种浓度的供试品；依法进样测定，计算回收率。3个浓度样品回收率分别为99.2%、99.8%和99.4%，RSD分别为056%、0.33%和0.40% 。

2.7 检测限 逐级稀释非布索坦对照品溶液，进样10µl，按信噪比为3∶1计算，测得非布索坦检出限为0.8ng。

2.8 稳定性试验 取供试品溶液，分别于室温下放置0、2、4、6、8 h后进样测定，记录峰面积，RSD 为0.89 %，表明供试品溶液在8h内稳定。

2.9 含量测定 取3批供试品溶液进样测定，记录色谱图；另取对照品溶液同法测定，按外标法以峰面积计算样品含量，结果3批样品（批号为：20101201、20101202、20101203) 的含量分别为99.4%、100.1%和100.5%。

3 讨论

非布索坦在乙醇、甲醇、乙腈中微溶，使用乙醇做溶剂时，杂质峰较大。最后选用溶解性能较好的甲醇作为溶剂。以乙腈－0.1%甲酸（55∶45）为流动相，其基线噪声、分离度、稳定性良好。因217nm 波长基线噪声大不易平衡，最后选用317nm为检测波长。在317nm波长处，非布索坦片杂质也有较强吸收。在室温时，非布索坦保留时间较长，将柱温提高到30℃时，保留时间在15min内。本研究建立了一种灵敏、快速、准确地测定非布索坦含量的高效液相色谱方法。