骨髓间充质干细胞移植对大鼠脑缺血再灌注损伤的修复作用

许长春，郭云霞，许科鹏

脑卒中已成为人类致死、致残的重要原因之一。其发病率有逐年上升的趋势。其中以缺血性卒中最为常见。传统观念认为脑缺血引起缺血区神经元不可逆死亡。梗死区周边的成熟神经元不能再生来弥补死亡的神经元，因此导致脑缺血预后不佳。最近的研究表明，骨髓间充质干细胞（MSCs）在某些内在机制和微循环影响下具有类似胚胎干细胞的高度分化能力，具有取材简单，来源丰富，可从患者自身获得而不存在组织相容性的问题，治疗时可避免长期应用免疫抑制剂对患者的损害，这为细胞移植治疗脑缺血损伤提供了可能。

1 材料与方法

1.1 动物及分组 成年雄性SD大鼠（上海实验动物中心提供）34只，质量270～320 g，模型制作过程中淘汰4只，30只脑缺血模型大鼠随机分为MSCs移植组，缺血对照组各15只。

1.2 MSCs的分离培养及鉴定 采用文献[1]方法，麻醉状态下取SD大鼠双侧股骨和胫骨，用DHank’s液冲洗骨髓腔收取骨髓，以密度为1.082 g/L的percoll淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离出骨髓单个核细胞，移到含10%FBS的DMEM-LG培养基中，结合贴壁法以1.0×104个/ml的细胞密度接种培养，按 1∶2进行扩增传代（1～3代）。选取生长良好的原代及1、2、3代细胞，用0.25%胰蛋白酶室温消化、离心，收集培养好的大鼠MSCs，将Hoeschst 33342加入大鼠MSCs培养基混悬液中，终质量浓度为50 μg/ml，于37℃培养箱中避光共同培养24 h，然后用 D-Hank’s液洗涤 3次以去除未结合的Hoeschst33342，并收集已结合Hoeschst33342的细胞，用不含胎牛血液的细胞培养液DMEM-LG将细胞制成细胞悬液。

1.2.1 大鼠脑缺血再灌注（MCAO）模型制作 参照文献[2]的方法，用直径0.32 nm的尼龙线插入大鼠右侧颈动脉，深度为20～22 mm，阻断右侧大脑中动脉，120 min后将尼龙线拔出。

1.2.2 MSCs移植 建立MCAO模型24 h后移植组于颈内动脉给予MSCS，悬浮液200 μl，细胞数为2×106个，对照组颈内动脉给与MSCs移植组同等体积的生理盐水作为对照。

1.2.3 神经损害严重程度评分（NSS） 参照文献[3]的方法，分别于移植后1、7、14、21 d对MSCs移植组及缺血对照组大鼠进行NSS，主要是运动，感觉功能，平衡能力及生理反射；总分为18分，正常为0分，分值越高其神经损害越严重。

1.2.4 免疫组化验测 于MSCs移植后1、7、14、21 d各组随机处死2只大鼠，4%多聚甲醛500 ml左心室灌注后，断头取脑，置4%多聚甲醛后固定24 h，冠状位切取以缺血区域为中心的包括侧脑室室管膜下区、基底节区的厚度2 mm的脑组织标本，石蜡包埋，连续切片，片厚5 μm，进行HE染色后镜检。

1.2.5 统计学方法 检测数据先求出组内均数±标准差，组间比较采用t检验。

2 结 果

2.1 MSCs的鉴定方法与分化 将所培养细胞经流式细胞仪检测。发现MSCs表面标记物CD29、CD44呈阳性表达，而CD14、CD34呈阴性表达，说明试验中分离培养的细胞非造血干细胞而为MSCs。经免疫组化分析，各代细胞90%表达Nestin阳性进一步证实是MSCs（胞质中出现大量的标黄色颗粒物）。

2.2 光镜下观察结果 各组均可见到明显梗死灶，位于基底节、皮质下白质和皮层，缺血区神经细胞明显减少，可见神经细胞变性、坏死呈胞体皱缩，核固缩碎裂溶解，胞浆浓缩红染，神经纤维输送，间质水肿明显，炎症细胞浸润。根据标记发现MSCs主要存在于脑皮质、皮质下等处。通过标记发现MSCs移植后1d在海马、皮质及小脑等部位部分MSCs细胞即可表达神经元标记物神经元特异性核蛋白，且随着移植时间的延长，标记的细胞数目增多。

2.3 NSS变化 MSCs移植后，1、7 d NSS与对照组比较无显著性差异 （7.8±1.4 vs 7.9±1.1，6.8±1.2 vs 6.9±1.2；P>0.05）， 但 14、21 d 移植组 NSS 均明显低于对照组 （5.0±1.2 vs 6.2±1.3，4.6±1.4 vs 5.9±1.0；P<0.05）。

3 讨 论

骨髓间充质干细胞是存在于骨髓中的一种非造血干细胞，具有多向分化潜能，可以分化为多种造血以外的组织细胞，特别是中胚层和外胚层来源的组织细胞。缺血性脑卒中现有的溶栓抗凝等治疗手段仍存在很大的局限性，不能根本改善脑梗死的预后。新近的研究表明，骨髓间充质干细胞可在一定的条件分化为神经元样细胞、星型胶质细胞等[4]。从而为神经系统疾病的治疗提供新的手段。动物实验证明神经干细胞移植可以在一定程度上修复脑缺血损伤，使神经功能得到明显改善，这说明神经干细胞移植是治疗神经功能损伤的有效手段，但由于神经干细胞数量很少，体外培养很难扩增，并且存在移植变异排斥等问题，从而使其应用受到很大的限制。而MSCs从骨髓中分离得到取材容易，且对健康无害，体外分离培养能快速扩增，可以自体移植而且不存在免疫排斥反应等问题。因此，MSCs在神经系统疾病的治疗中占有越来越重要的地位。

本实验中，笔者用MSCs颈内动脉移植治疗大鼠缺血性损伤，大鼠的神经功能恢复明显优于对照组，MSCs移植组神经细胞变性、坏死数量明显减少，炎症细胞减少，水肿减轻，以上情况提供了行为学上和病理学上的实验依据，说明以MSCs治疗缺血性脑损伤是切实有效的。

一般认为MSCs对脑缺血再灌注损伤的保护主要有以下几种机制：①作为干细胞，MSCs可能在脑组织中分化为神经元样细胞和神经胶质样细胞，替代发生坏死和凋亡的神经细胞，从而起到脑保护作用，但是分化的比率较低，分别为1%和8%，如此少量的分化细胞能发挥多大的神经替代功能有待进一步的研究；②MSCs激活了存在于皮质下区的神经干细胞（NSC）[5]，被激活的内源性NSC进一步定向分化为神经细胞起到脑保护作用；③MSCs进入脑组织内部可分泌和（或）促进神经细胞分泌神经营养因子、血管内皮生长因子、神经生长因子和干细胞生长因子等[6]，这一机制已得到公认。

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[3]Chen J,Li Y,Wang L,et al.Therapeutic benefit of intravenous administration of bone marrow stronal cells after cerebral ischemia in rats[J].Stroke,2001,32:1005-1011.

[4]ZHANG Hua-biao,XU Yu-ming,ZHANG Su-ming.The experimental study on rat mesenchymal stem cells induced to differentiate into nerve-like cells in vitro[J]Chinese Journal of Neuroimmunology and Neurology,2003,10(4):276.

[5]Sato K,Iwai M,Nagano I,et al.Temporal and spacial changes of BrdU immunoreactivity in amygdala kindling development.Neurol Res,2002,24:593.

[6]Chen X,Li Y,Wang L,et al.Ischemic rat brain extracts induce human marrow stromal cell growth factor production.Neuropathology,2002,22:275.