MANF/CDNF与神经系统疾病

刘淼,王伟,喻志源

华中科技大学同济医学院附属同济医院神经科,武汉430030

1 概述

神经营养因子是一类小分子分泌蛋白,通过与相应的受体结合,调节神经细胞的生长、发育、成熟与存活,尤其在调控神经元的数量、突起的分支、突触的形成和神经细胞表型的成熟等发面发挥重要作用。神经营养因子还有促进损伤后神经元再生,治疗慢性神经系统疾病的功能[1-3]。中脑星形胶质细胞源性神经营养因子(mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor,MANF)是 Petrova等[4]于2003年首次在体外传代培养的大鼠中脑Ⅰ型星形胶质细胞的培养基中分离到的一种能促进体外多巴胺神经元存活的神经营养因子,分子量为18 kD,也被称为ARMET(arginine rich,mutated in early stage of tumurs)或 ARP(arginine-rich protein)。脊椎动物中存在的另一种神经营养因子保守型多巴胺神经营养因子(conserved dopamine neurotrophic factor,CDNF),是MANF的同类物[5],二者的同源性＞59%[6],都属于含8个半胱氨酸残基保守序列的蛋白家族[4,5,7]。

哺乳动物的MANF/CDNF mRNA和蛋白广泛表达于中枢神经系统[5,8],在大脑皮质、海马及小脑浦肯野细胞中相对高表达[8];在肺、肌肉、睾丸和胃等一些组织中也有丰富的表达[5,8]。MANF/CDNF的基因在进化上高度保守,从线虫到人的各级动物中均有表达,是迄今在无脊椎动物中发现的唯一一个神经营养因子家族[6]。但序列分析发现脊椎动物中同时含CDNF和MANF 2种基因[5],无脊椎动物中却只含有1种与MANF更具相关性的同源基因[6]。MANF基因缺失的果蝇会因多巴胺神经元的数量和多巴胺水平的减少而死亡,给予人源性的MANF可以发挥替代功能[6]。这也表明该神经营养因子在2种动物中可能采用相同或相似的信号传导机制来完成神经营养功能,而且在漫长的生命进化过程中这一功能不可替代。

2 MANF/CDNF的生物结构特点

传统的神经营养因子主要分为3个超家族[9,10]:①神经营养因子超家族:神经生长因子(nerve growth factor,NGF),脑源性神经营养因子(brain derived neurophic factor,BDNF),神经营养因子-3(neurotrophin-3,NT-3),神经营养因子-4/5/6/7(NT-4/5/6/7);②神经生成细胞因子超家族:睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor,CNTF),白介素-6(interleukin-6,IL-6),心肌营养因子-1(cardiotrophin-1,CT-1);③胶质细胞源性神经营养因子超家族:胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line derived neurotrophic factor,GDNF),neurturin(NRTN),artemin(ARTN),persephin(PSPN)。但哺乳动物中MANF/CDNF的蛋白结构与以往任何一种神经营养因子相比都大不同,因此被列为一类新型的神经营养因子家族[9]。

最初的研究发现MANF基因的氨基末端是一段富含精氨酸的序列,该序列在多种肿瘤的早期存在单个核苷酸突变[7,11,12],因此被认为与肿瘤的发生有关。而随后的研究却发现,成熟的MANF上并未发现该段精氨酸富集区的表达[4,13],MANF基因中出现的这种突变非肿瘤所特有,而是属于正常基因的多态性[14,15]。目前的研究表明,MANF/CDNF的结构由2个区域组成[16]:氨基末端是疏水的saposin样结构域,其表面含有数个保守的精氨酸和赖氨酸残基,带有丰富的正电荷,可能与膜磷脂表面或脂质受体的负电荷产生静电作用[9,10,16,17],推测其与神经营养活性的发挥有关;羧基末端是一个可溶性结构[18],含有由8个保守的半胱氨酸残基形成的4个二硫键[5],组成2个CXXC的模序结构[18],这一结构与胞内催化二硫键形成的硫醇类氧化还原酶的结构相类似[9],而且该末端的KDEL样序列表明MANF/CDNF在内质网腔内有表达[13,19,20],推测MANF/CDNF可能与内质网中蛋白质的氧化折叠有关。MANF/CDNF是否有氧化还原活性有待进一步研究证实。另外,MANF的羧基末端区域与Ku70的SAP结构域同源,因此它可能是促凋亡蛋白Bax的另一个抑制因子[21]。

3 MANF/CDNF的生理功能

早在上世纪90年代,Omalley等[22]就发现体外培养的黑质胶质细胞能促进多巴胺神经元的存活,随后在体外培养细胞的培养基中分离到MANF和CDNF[4,5],并证实它们能选择性地保护多巴胺神经元,而对5-羟色胺能 、γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid,GABA)能及周围神经元无影响[4,5]。又有研究显示MANF与内质网膜和高尔基体膜蛋白均有共定位现象,用布雷菲德菌素A(Brefeldin A,BFA)阻断内质网和高尔基体之间的蛋白运输,致使内质网中的该类蛋白增多而培养基中的量却减少[19];随后在MANF基因缺失的果蝇中观察到多巴胺神经元轴突的退变、多巴胺水平下降和幼虫的死亡[6],这些证据支持MANF是一种多巴胺神经元营养因子。现在有学者认为MANF/CDNF可能是胶质细胞通过旁分泌的形式对其周围的神经元起营养作用[5],但它发挥营养神经元功能的受体和下游机制目前还不清楚。

有研究证明实际上仅有很小一部分 MANF/CDNF被分泌到细胞外[19],在内质网腔内它们也有丰富的表达[13,19,20],说明MANF/CDNF不仅有营养神经细胞的作用,还参与细胞内的其它生命过程。内质网是真核细胞的重要细胞器,与各种膜蛋白、分泌蛋白、磷脂、胆固醇等的代谢过程密切相关。在疾病或有害因素的影响下,内质网发生功能紊乱,导致内质网腔内未折叠蛋白或错误折叠蛋白的堆积等,即为内质网应激。许多神经系统疾病的早期都会发生内质网应激,应激信号能通过内质网膜传递到细胞核中,继而引起未折叠蛋白反应[23],处理异常蛋白的集聚,促使细胞存活[24];但长时间的内质网应激可引起细胞凋亡。越来越多的证据表明MANF是一种内质网应激反应蛋白[13,19,25,26],高表达MANF能增强细胞对无糖状态和其它内质网应激诱因的耐受性[19],而对MANF基因的体外 RNAi或者在体敲除可使细胞或有机体在内质网应激时发生死亡[19]。因此,MANF上调可能是细胞在内质网应激时的一种内源性神经保护机制的激活,其具体分子机制目前尚在研究中。Mizobuchi等[13]初步研究认为内质网应激是通过内质网应激反应元素Ⅱ来上调MANF的表达量,MANF可能通过降解错误折叠蛋白、或处理未折叠蛋白、或调控内质网应激感受器活性来参与未折叠蛋白反应[19],改善细胞生理状态。然而CDNF的表达量在内质网应激时未发生明显变化[19],推测它可能是内质网的结构蛋白质之一。

MANF/CDNF在胞外有神经营养因子活性,在胞内参与内质网应激反应保护细胞,这两种功能之间是否相互关联,还有待进一步研究。

4 MANF/CDNF与神经系统疾病

4.1 MANF/CDNF与帕金森病 帕金森病是一种神经退行性疾病,对帕金森病的治疗目前仍以药物对症治疗为主,可改善患者的生活质量,但并不能减慢或阻止疾病的进展。促进多巴胺神经元存活或重建多巴胺能神经系统正常功能的治疗方法意义重大。某些神经营养因子在帕金森病患者黑质中表达量不足[16,17],多种帕金森治疗药物也表现出调节神经营养因子的现象。许多神经营养因子在体外培养细胞中已显示出多巴胺神经元保护作用,目前在动物模型中显示出治疗作用的神经营养因子并不多,包括 GDNF、BDNF、NRTN 和 MANF/CDNF等[10]。其中GDNF、NRTN已经进入临床研究阶段,但其 Ⅱ期临床双盲试验的有效率并不明显[9,29,30]。应用GDNF治疗还出现血清反应和小脑损伤等一系列严重的副反应[29-31],使其临床应用价值受到质疑。近年来研究证明,胶质细胞中MANF/CDNF基因缺失会导致动物体内多巴胺神经元缺失和多巴胺不足引起的一系列病理反应[6]。在6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)诱导的大鼠帕金森模型中,通过纹状体内注射MANF/CDNF不但能保护中脑多巴胺神经元和纹状体多巴胺神经纤维,而且能加强存活神经元的功能、修复受损的黑质-纹状体多巴胺系统[5,9,32],减少帕金森大鼠的运动障碍,具有预防和治疗的双重潜在作用。与GDNF、NRTN相比,MANF/CDNF具有以下优点:对细胞外基质亲和力低[32,33],扩散范围较大;选择性作用于多巴胺神经元,对周围运动、感觉神经元和交感神经元无影响[4,5],副作用小;在低、中药物浓度时的选择性较GDNF和BDNF高[4,9]。这些特点显示出MANF/CDNF在帕金森病防治中较大的应用前景。

4.2 MANF/CDNF与脑缺血损伤 神经保护是治疗缺血性脑血管的有效方法之一。脑缺血时,神经营养因子能够维持细胞内环境的Ca2+和自由基代谢的稳定,阻止因兴奋毒性或过氧化所致皮质或海马的神经元死亡或凋亡。MANF不仅存在于中脑多巴胺神经元中,在大脑皮质和海马组织中也有丰富的表达[8];脑缺血会引起海马和大脑皮质MANF表达的变化[8,19,34]。一过性或永久性脑缺血会引起异常蛋白在内质网内的积聚[35],发生内质网应激,激活未折叠蛋白反应,上调神经元中MANF/CDNF的表达量[8,19],并增强其免疫活性[19],可减少缺血区神经元的过多凋亡和坏死[36]。MANF预处理可以减小脑缺血大鼠梗死灶的体积,有利于行为学功能的恢复[36],这可能和缺血灶中反应性增生的胶质细胞减少有关,此假说与MANF抑制体外培养细胞的增殖相一致[19]。另外,脑缺血后MANF的表达在神经元和胶质细胞中发生重新分布,推测可能和MANF神经营养功能有关。CDNF在动物脑缺血后有无保护作用还在研究中。

4.3 其他 MANF/CDNF在其它神经系统疾病中的研究较少。Lindholm等[8]利用电刺激诱导小鼠癫痫持续状态后,会引起海马颗粒细胞层、丘脑网状核和大脑皮质某些区域的MANF mRNA表达一过性增高,提示MANF与癫痫发生、发展或恢复存在某些联系。

5 前景展望

哺乳动物的MANF/CDNF表达范围广泛,基因进化保守,在多种脑损伤后其表达量与蛋白分布均受到不同程度的调节[8,32,36],提示其在生理和病理状态下都发挥重要作用。MANF/CDNF作为一类分泌蛋白,在内质网应激时表达上调,该特点可使其作为亚健康状态或疾病早期的一个预警信号。MANF/CDNF不仅以胞外分泌的形式起到营养神经元的功能,在胞内也发挥着普遍的细胞保护作用;又由于这类神经营养因子与以往神经营养因子的结构大不相同,可能是通过一种新的信号途径来起作用[21],因此对其深入研究可能为临床神经系统疾病的综合治疗提供支持。

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