代谢组学技术在药物安全性研究中的应用

方 舟,方 芳,孙长海

(1.佳木斯大学药学院,黑龙江佳木斯 154007;2.佳木斯大学第一附属医院药剂科,黑龙江佳木斯 154003)

经典的对药物等化合物的安全性评价,是通过给予一定数量的实验动物大剂量的待测化合物,观察其毒性效应特征,然后将其实验结果外推到接受小剂量相同化合物的大量人群。它是一项涉及多学科的综合性的毒理学评价过程。然而,这些评价手段还存在着许多缺点,比如实验动物和人对药物反应存在种属差异;动物使用剂量与人体实际接触剂量的差异;动物数量有限,难以发现发生率低的毒性反应等;此外还有实验周期长及费用昂贵等问题[1]。因此,研究筛选灵敏度高、特异性强和实验周期短的药物安全评价方法是毒理学科研工作者十分关心的重大课题。

与经典方法相比,代谢组学能更快、更准确地发现毒性物质及其毒性规律,尤其对于多靶点的综合性毒性反应,代谢组学可从多个角度进行全面评价,故有利于药物的研发和药物安全性方面的研究。

代谢组学是20世纪90年代初兴起的一门对细胞、组织或器官以及整个生物体系所有小分子代谢产物进行定性、定量分析的新技术。它采用核磁共振(NM R)或质谱(MS)技术为主要检测手段,将测量得到的生物体液、组织的代谢数据与化学计量学联系起来,建立复杂生物体系的代谢谱图,与基因组学、转录组学、蛋白质组学一起揭示生命运动的本质和规律。近年来,代谢组学已经广泛应用于毒理学和药理学(如药物安全性评价、生物标志物的鉴别及毒性的分类和筛选等)、功能基因组学(如鉴别和确证动物模型)、疾病诊断、环境毒理学等。本文仅就代谢组学在药物安全性评价方面的应用作初步论述。

1 代谢组学概况

1999年,Nicholson小组[2]基于对生物体和细胞内小分子代谢产物的多年研究提出了“代谢组学”的概念。代谢组学是效仿基因组学和蛋白质组学的研究思想,对生物体内所有代谢物进行定量分析,并寻找代谢物与生理病理变化的相对关系的研究方式,是系统生物学的组成部分。其研究对象大都是相对分子质量1000以内的小分子物质。先进分析检测技术结合模式识别和专家系统等计算分析方法是代谢组学研究的基本方法。

代谢组学的分析方法多种多样,以核磁共振波谱法和色谱-质谱联用法为主[3]。核磁共振波谱法包括核磁共振氢谱法,核磁共振碳谱法,核磁共振磷谱法,色谱-质谱连用法包括GC-MS和 HPLC-MS。

药物代谢产物是在药物代谢酶的作用下生成的最终产物,通过对机体代谢产物的深入研究,可以判断机体是否处于正常状态,而对基因和蛋白质的研究都无法得出这样的结论。目前,已经研究清楚的普通代谢途径包括三羧酸循环(TCA),糖酵解,花生四烯酸(AA)/炎症途径。

在代谢组学的研究中,如果试验中发现样本中三羧循环底物异常时,则提示可能与机体能量代谢途径的紊乱相关,同时三羧循环氧化酶系均存在与细胞的线粒体中,因此,三羧循环的紊乱可能预示着线粒体的紊乱。在代谢组学的研究中,三羧循环的紊乱是被检测到频率最高的代谢通路之一。

有研究表明[4],尿液中牛磺酸含量的变化是检测肝脏损伤的重要指标。柠檬酸、2-酮戊二酸是三羧酸循环的中间产物,其变化与肝脏能量代谢相关,可反映肝脏线粒体的功能[4,5]。

代谢组学研究的技术平台包括以下几个部分:样品的收集、生物反应的淬灭、样品预处理、仪器分析与鉴定、数据分析和标志物生物学意义解读以及机体生化反应机制和生命现象的认知。其中,代谢产物的检测、分析与鉴定是代谢组学技术的核心部分,它主要利用LC-MS、GC-MS以及NM R等各种高通量、高分辨、高灵敏度的谱学技术对样品进行分离分析 。但由于各种技术均有其各自的优缺点和适用范围,且内源性化合物具有理化性质多样性、浓度范围变化大等特点,故需采用各种技术联用和方法整合的策略,保证尽可能精确地分析生物体系中尽量多的代谢组分,使整个分析过程尽可能多地保留样品中代谢物的整体信息。利用谱学技术分析获得的代谢指纹图谱,经过现代化学计量学和生物统计学领域的新方法对其进行降维和信息挖掘得到可用于代谢组学研究的格式。

2 相关研究与应用

将代谢组学用于药物毒性和安全性的评价已成为目前新药开发过程中一项倍受关注的研究课题,国外不少政府部门和单位已经组建了相关机构和组织专门从事此项工作,如21世纪初,英国伦敦大学帝国理工学院与6家医药公司联合成立了一个研究组织—Consortium for Metabonomic Toxicology(COMET),其主要研究目标是建立可用NM R从尿液和血浆样本中获得代谢数据,以用于候选药物临床前的毒性测试的一整套毒理代谢组学研究体系和通用的标准评价方法。如今,该组织已分析了多种对肝脏和肾脏具有毒性的模型毒物,测定了它们在尿液和血清(包括生物组织)中的代谢数据,并已计划据此建立一个含有大量模型毒物信息的数据库,进而开发能对更多模型药物进行分析的专家系统,以对候选药物的肝脏和肾脏毒性进行毒理学筛选,从而降低新药的创新成本,缩短研发周期[6]。

此外,在对已有药物,尤其是中药的安全性评价方面,代谢组学技术也发挥了它的作用,如美国食品和药品管理局(FDA)启动了开展植物药安全性和药物毒性评价的代谢组学研究计划;荷兰还专门成立了针对中药的代谢组学研究中心,对药物的安全性进行评价。近年来,在刘昌孝等院士的倡导下[7]国内也已开展了一些对药物安全性评价的代谢组学的研究。

廖艳[8]等基于核磁共振氢谱法对异烟肼肝毒性的代谢组学特征进行了研究,将大鼠连续经口灌胃 0、50、100、200和400mg/kg异烟肼,3、7、14d收集给药前 24h及给药期间每天24h的尿液,测定质子核磁共振谱,并进行血浆生化指标测定和肝脏组织学检查。结果常规毒性研究方法显示异烟肼在较高剂量、较长给药时间(7d以上)时表现出肝毒性,并且有较好的时间-效应关系。对大鼠尿液进行代谢组学研究显示各组动物代谢谱各不相同,随着给药时间的变化大鼠尿液NMR谱发生一定改变,代谢谱的改变与常规毒性检测指标相符且更灵敏。与正常对照组比较给药组尿样NM R谱葡萄糖和牛磺酸显著增加,2-酮戊二酸和柠檬酸显著降低。大鼠尿液NM R代谢轨迹与异烟肼毒性作用时间密切相关,异烟肼引起的肝毒性与线粒体功能受损、三羧酸循环中能量代谢异常及葡萄糖代谢紊乱有关。

廖艳等[9]还按照同样方法研究利福平肝毒性时效关系,将大鼠随机分成两组和1个空白组,使用两个不同浓度给药,结果各组大鼠尿液的代谢谱各不相同,随着时间的推移,大鼠尿液NMR谱发生一定改变,尿样NMR谱葡萄糖和牛磺酸显著增加,2-酮戊二酸和柠檬酸显著降低。同样大鼠尿液NM R代谢轨迹与利福平作用时间密切相关,利福平引起的肝毒性与三羧酸循环中能量代谢异常及葡萄糖代谢紊乱有关。

刘霞[10]等基于NM R代谢组学方法分析马兜铃酸I(AA-I)诱导的雌雄小鼠急性肾毒性,分析了小鼠尿样的代谢特征,揭示出马兜铃酸I(AA-I)导致急性肾毒性的分子机理及其在雌性和雄性小鼠上差异的根源。研究结果表明,AA-I的急性肾毒性主要来自AA-I给药后抑制了体内的三羧酸(TCA)循环和能量代谢,破坏了体内肠道菌群的生态平衡,改变了肾脏细胞内外的渗透压,从而引起了肾小管的损伤。代谢模式分析显示雄性小鼠对AA-I的肾毒性比雌性小鼠更敏感,可能源于雄性小鼠本身更低的能量代谢。

Chan等[11]采用高效液相色谱飞行时间质谱联(HPLC/TOF-MS)方法研究了服用马兜铃酸后大鼠尿液的代谢图谱,发现犬尿烯酸和马尿酸为反映药物毒性的生物标志物,可用作评价马兜铃酸毒性的生物学指标。

梁琦[12]等人进行基于核磁共振氢谱法的广防己的肾毒性代谢组学研究,他们选择大鼠为实验动物,收集尿液,将大鼠随机分为两组,1个正常对照组,1个给药组,灌胃给药。他们发现马尿酸盐、肌酐、TM AO在尿液中的含量有上升阶段,这表现肾脏损伤能增加肾脏的滤过作用。他们还发现大鼠尿液中的牛磺酸的含量上升,柠檬酸的含量下降,2-酮戊二酸的含量下降,认为广防己还能引起肝毒性。他们还进行血清生化分析和肾脏病理学观察。

赵剑宇[13]等采用基于NM R的代谢组学方法研究了大鼠经关木通染毒后,尿液的代谢表型改变及其与组织病理及尿液、血浆生化指标的相关性:实验大鼠被分别灌胃给予不同剂量的关木通,每天 1次,连续6d;最后,服用关木通各剂量组大鼠肾脏出现不同程度的炎症坏死,尿样中氧化三甲胺、枸橼酸、牛磺酸、肌酐、甜菜碱等内源性代谢物水平均有不同程度的下降,而醋酸、丙氨酸水平则显著上升;分析表明,空白对照组与关木通组的代谢谱有明显差异,而造成组间差异的主要是醋酸和氧化三甲胺的变化,在不同剂量条件下,关木通各组大鼠的代谢谱也各不相同,而此与肾脏病理和血浆生化改变相一致。

李建新等[14]采用基于NM R的代谢组学方法研究了雷公藤甲素的肾脏毒性,发现尿样中甜菜碱、二甲基甘氨酸为反映药物对肾乳头毒性的生物标志物;内源性化合物醋酸盐、乳酸、甘氨酸为反映药物对肾脏皮层S1段毒性的生物标志物;丙酮为反映药物对肾脏皮层S3段毒性的生物标志物。其中以醋酸盐、甜菜碱和丙酮含量升高最为显著。这些代谢物的变化说明大鼠尿液代谢组学分析能够较好地反映雷公藤甲素的肾毒性特征,并能对毒性作出早期预测。

樊夏雷等[15]人应用GC/MS及模式识别技术为核心的代谢组学方法对大鼠尿样及血浆样品进行研究,结果表明,给药后2d和4d,血浆中代谢组水平、大鼠尿液与给药前产生明显变化,内源性代谢产物谱随时间动态变化明显,能够明显区分出各天的变化趋势,表征出毒性发生,发展的动态过程。得出结论是关木通能够对肾脏造成损害。应用基于GC-MS的代谢组学方法,初步获得关木通致肾脏损害的“代谢产物谱”,根据不同的代谢表型能够区分出关木通的毒性作用。大鼠尿液、血浆中的代谢产物谱与关木通毒性作用的经时过程密切相关,能够很好区分出机体的不同中毒状态。

3 结语

代谢组学技术为药物安全性研究提供了新的思路与方法,在药物安全性研究中已取得了一定的成果,但仍有些不足,目前代谢组学在理论和技术上还有很多问题有待解决,例如分析检测技术和数据处理技术还有待提高,得出数据的可靠性还未得到确证等,这在一定程度上限制了代谢组学在药物安全性评价中的进一步应用。药物安全性历来是临床应用中倍受关注的问题,特别中药安全性问题是中药国际化的主要障碍之一。由于中药种植的生态环境、炮制方法、配伍应用、体内生物转化产物、生物活性和临床应用均存在多样性的特点,故很难逐一搞清其中的哪一种化学成分产生的毒副作用,而代谢组学因其高通量及灵敏度和特异性上的优势将会成为阐明某些中药毒性及安全性的有效方法和途径之一。将能反映整体观的代谢组学用于对中草药毒性的研究,对于确保中药用药的合理性和安全性,建立现代中药的药理、毒理评价体系,指导临床拟订合理的临床用药方案、剂量和时间均有理论意义和实用价值[7],且对我国当前的中药安全性研究起到推动作用。相信随着科学技术的发展,各种组学数据的成功对接,代谢组学、基因组学、转录组学、蛋白质组学等系统生物学的方法必将对药物的安全性方面的研究产生推动作用。

[1]Johnson DE,Wolfgang GH.Assessing the potential toxicity ofnew pharmaceutics[J].Current Topics Med Chem,2001,1:233-245

[2]Nicholson JK,Lindon JC,Holmes E.Metabonomics:understanding the metabolic responses of living sy stems to pathophysiological stimuli viamultivariate statistical analysis of biological NMR spectroscopic data[J].Xenobiotica,1999,29(11):1181-1189

[3]陈慧梅,刘志红.代谢组学及其研究方法和应用[J].肾脏病与肾透析移植杂志,2005,14(1):59-63

[4]Jaeschke H,Go res GJ,Cederbaum AI,et al.Mechanisms of hepatotoxi2city[J].T oxicol Sci,2002,65(2):166-176

[5]廖艳,彭双清,颜贤忠,等.抗结核药物异烟肼肝毒性时效关系的代谢组学[J].中国医学科学学报,2007,29(6):730-737

[6]Ebbe ls T,Keun H,Beckonert O,et al.T oxicity c lassification from m etabonom ic data using a density superposition approach“CLO UDS ”[J].Anal Chim Acta,2003,490(1/2):109-122

[7]刘昌孝.代谢组学的发展与药物研究开发[J].天津药学,2005,17(2):1-6

[8]廖艳,彭双清,颜贤忠,等.异烟肼肝毒性的代谢组学特征研究[J].中国新药杂志,2007,16(4):288-292

[9]廖艳,彭双清,颜贤忠,等.利福平致肝脏毒性的代谢组学特征研究[J].中国新药杂志,2007,16(16):1260-1265

[10]刘霞,肖瑛,高红昌,等.基于1H NM R代谢组学方法分析马兜铃酸I诱导的雌雄小鼠急性肾毒性[J].高等化学学校学报,2010,5,31:927-932

[11]ChanW,Ca i Z W.Ar isto lochic acid induced changes in the m etabo lic pro file o f rat ur ine[J].J Pharm Biomed Anal,2008,46(4):757-762

[12]梁琦,倪诚,谢鸣,等.广防己的肾毒性代谢组学研究[J].中西医结合学报,2009,87(8):746-752

[13]赵剑宇,颜贤忠,彭双清.关木通的肾毒性代谢组学研究[J].中草药,2006,37(5):233-241

[14]李建新,华嘉,何翠翠.中药毒性的代谢组学研究(#):雷公藤甲素的肾脏毒性[J].亚太传统医药,2007,3(7):41-45

[15]樊夏雷,刘文英,王广基,等.基于GCPTOFPMS的关木通肾毒性代谢组学研究[J].毒理学杂志,2007,21(4):323