CRE-decoy ODN对大鼠吗啡戒断症状的抑制作用

李华 王丽 秦星 苏彦君 郝存勋

有研究认为，阿片和其他成瘾药物具有共同的细胞和解剖通路，而受体后细胞、突触和神经网络的适应性改变是成瘾性形成的关键［1］。阿片类药物与其受体结合后，通过升高细胞内cAMP［2－4］和游离 Ca2+浓度 (intracellular free Ca2+concentra-tion，［Ca2+］i)［5，6］，分别激活 cAMP 依赖的蛋白激酶 A(cAMP-dependent protein kinase A，PKA)［2－4］及钙调蛋白依赖蛋白激酶(calmodulin-dependent kinase，CaMK)［7－9］，使转录因子 cAMP反应元件结合蛋白(cAMP response element-binding protein，CREB)的Ser-133磷酸化，而持续调节其下游基因表达，参与神经元与突触的可塑性与适应性［2－4，7－10］。本研究在体外观察CRE-decoy ODN可选择性下调慢性吗啡诱导SK-N-SH细胞的CREB的DNA的结合活性、nNOS及fosB基因表达上调的基础上，进一步在体观察CRE-decoy ODN对吗啡依赖大鼠戒断症状的影响，为探寻阿片类物质依赖的干预措施提供实验依据。

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 仪器:可调定量移液器(2～1 000 μl)购自法国Gilson公司;微量注射器购自上海医用器材厂;S2-93自动双重纯水蒸馏器购自上海强申生化仪器厂;江湾I-C型脑立体定位仪购自第二军医大学生理学教研室。

1．1．2 试剂及用品:盐酸吗啡购自沈阳第一制药厂;盐酸纳络酮购自美国Sigma公司;多聚甲醛、Na2HPO4、NaH2PO4购自北京化学试剂厂;全硫代磷酸化CRE-decoy ODN(5’-TGACGTCA TGACGTCA TGACGTCA-3’)由上海Sangon公司合成。

1．1．3 实验动物:雄性Wistar大鼠(清洁级)40只，体重200～240 g，购自河北医科大学实验动物部。

1．2 方法

1．2．1 动物分组:40只Wistar大鼠在动物实验室适应饲养3 d后，随机分为5组，即0．9%氯化钠溶液对照组，侧脑室0．9%氯化钠溶液注射对照组，吗啡依赖组，吗啡戒断组，吗啡戒断CRE-decoy ODN治疗组，每组8只。分笼饲养，每笼5只。实验室通风良好，饲养温度(24±1)℃，相对湿度50%，黑/白照明周期为12/12 h。大鼠自由饮水、进食，保持垫料干燥。饲料中蛋白含量为20%，胆固醇含量为3．5%。

1．2．2 动物模型制备:采用递增剂量皮下注射建立大鼠吗啡身体依赖模型。方案为:第1天皮下注射盐酸吗啡10 mg/kg，2次/d。吗啡用量每日递增10 mg/kg，连续5 d。第6天皮下注射吗啡50 mg/kg，2 h后腹腔注射盐酸纳络酮5 mg/kg进行催瘾实验。0．9%氯化钠溶液对照组和侧脑室0．9%氯化钠溶液注射对照组大鼠注射等体积0．9%氯化钠溶液。

1．2．3 大鼠侧脑室微量注射:吗啡戒断治疗组在末次注射吗啡前30 h，对每只大鼠左侧侧脑室内注射溶解在10 μl saline 0．9%氯化钠溶液中的CRE-decoy ODN 20 μg。在相应的时间点，对侧脑室0．9%氯化钠溶液注射对照组、吗啡依赖组、吗啡戒断组每只大鼠则于左侧侧脑室内注射等体积0．9%氯化钠溶液。左侧侧脑室注射的具体操作过程如下:大鼠在0．4%戊巴比妥钠(40 mg/kg，侧脑室内注射)麻醉下，根据文献［11］，借助脑立体定位仪行左侧侧脑室注射。注药点:前卤后0．8 mm，中线旁 1．8 mm，硬膜下 3．7 mm。注射体积 10 μl，20 s 完成注射后，缝合皮肤。

1．2．4 吗啡戒断大鼠的行为学评定

1．2．4．1 对计数和观察症状评分:在纳络酮催瘾之前1 h，把0．9%氯化钠溶液对照组及行左侧侧脑室注射术后活动正常的大鼠单独放进一个直径30 cm、高50 cm观测筒内，使大鼠适应检测环境。腹腔注射纳络酮后，不知情的观测者随即观测大鼠的戒断行为，并进行评分。需连续观察1 h。①需观测的戒断症状包括两类，即计数症状和观察症状。计数症状需记录湿狗样抖动、牙齿颤抖、吞咽和跳跃的发生次数，再对其进行评分。评分标准为:0=不发作，1=发作1～5次，2=发作6～10次，3=发作≥11次。每15分钟为一时间段，连续观测1 h内上述行为的发生频率，最后计算戒断0～60 min的总评分。②需观测6种观察症状在戒断0～60 min的出现程度，即上睑下垂、流泪、流涎、竖毛、激惹(irritability)和腹泻(diarrhea)，最后对其进行评分。评分标准为:0=未出现，1=轻度，2=中度，3=明显。

1．2．4．2 体重丢失的评分:体重丢失百分率(ΔW)=纳络酮注射前与注射后1 h的体重差/纳络酮注射前体重×100%。ΔW的评分标准为:1=ΔW＜2%，5=ΔW＜4%，10=ΔW＜6%，15=ΔW＜8%，20=ΔW≥8%。

1．2．5 左侧侧脑室注射部位及其周围脑组织损伤的鉴定:纳络酮注射后2 h，大鼠在0．4%戊巴比妥钠(40mg/kg，侧脑室内注射)麻醉下，将大鼠胸腹腔切开，暴露心脏。先剪开右心耳，见血液流出后，将左心室剪开，将已注入预冷0．9%氯化钠溶液的灌注管从左心室插入升主动脉，快速灌注约150 ml预冷0．9%氯化钠溶液，右心耳流出液变清亮后，灌注4%多甲醛。首先在20 min内灌注200 ml，随后在40 min内灌注200 ml。取脑并将脑组织在4%多甲醛中固定2 h后，放入15%和30%梯度蔗糖溶液中直至沉底。肉眼观察侧脑室微量注射管定位。

1．3统计学分析应用SPSS 11．0统计软件，计量资料以±s表示，进行单因素方差分析，两两比较用S-N-K法，P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 侧脑室微量注射管定位 观察微量注射管定位准确，对周围脑组织损伤较小。

2．2 侧脑室注射CRE-decoy ODN对大鼠戒断症状的影响 大鼠的戒断症状由腹腔注射盐酸纳络酮5 mg/kg催促。在腹腔注射纳络酮前，5组大鼠均未出现戒断症状。在吗啡戒断大鼠侧脑室注射CRE-decoy ODN 20 μg，可明显抑制绝大部分戒断症状。0～60 min内，CRE-decoy ODN治疗组大鼠每15分钟的行为学评分分别为(3．2 ±0．6)、(5．9 ±0．9)、(4．1 ±0．6)和(1．8±0．4)分，明显低于戒断组大鼠的(6．3 ±0．8)、(8．1 ±0．7)、(6．9 ±0．9)和(2．8 ±0．7)分，差异有统计学意义(P ＜0．01)。CRE-decoy ODN明显抑制吗啡戒断大鼠0～60 min戒断症状的总评分，使其从(24．0 ±0．7)分降至(15．0 ±0．9)分(P＜0．01)，并使反映戒断症状综合性指标的体重丢失百分率ΔW 从(7．2 ±1．2)%降至(4．1 ±0．8)%(P ＜0．01)。

3 讨论

阿片药物成瘾的主要特征为耐受、戒断综合征及强迫用药，目前对其形成的生物学基础尚未阐明［1］。研究表明，反复应用阿片类药物，机体启动适应机制，导致对阿片敏感的神经元及神经网络的功能发生短期及长期改变［9］。

寻找与成瘾有关的极其稳定的分子适应机制所遇到的困难，与学习和记忆领域面对的挑战相同［1，10］。可能的机制之一是通过CREB介导很短暂的基因表达改变，而介导神经元形态学和突触结构的长期改变。例如，在海马锥体神经元，增加树突突起的密度及LTP时谷氨酸能突触的效力。另一种可能是转录因子CREB的短暂激活通过修饰染色质，导致基因表达更持久的改变。CREB和许多其他的转录因子被认为通过促进靶基因周围的组蛋白发生乙酰化或去乙酰化而激活或抑制靶基因转录。尽管组蛋白乙酰化或去乙酰化发生非常快，但是CREB在控制组蛋白乙酰化的酶系统方面产生更持久的适应。CREB也可能通过调节DNA或组蛋白的甲基化使基因表达发生更持久的改变［10］。

CREB主要通过cAMP反应元件(cAMP response element，CRE)介导cAMP和Ca2+依赖的基因表达。CRE由TGACGTCA序列组成，主要位于许多基因启动子内TATA盒上游100个核苷酸处［7，11］。酶复杂的级联反应调控CREB的活性。细胞外刺激通过升高细胞内cAMP或游离Ca2+，在数分或数秒钟后，CREB便被激活。随着胞外刺激引起胞浆内cAMP水平升高，PKA的催化和调节亚单位迅速分离，催化亚单位被动移位至细胞核，并在细胞受到刺激后15～20 min达到高峰。PKA导致CREB内的PKA磷酸化位点(RRPSY)中Ser-133磷酸化。Ser-133磷酸化被认为是介导转录起始的关键事件，细胞内Ca2+水平升高通过Ca2+/钙调蛋白依赖蛋白激酶Ⅳ(calmodulin-dependent kinaseⅣ，CaMKⅣ)使 Ser-133磷酸化。Ca2+激活CREB可通过钙调蛋白从胞浆移位到胞核。当CREB经磷酸化激活形成pCREB时，pCREB便于特定的DNA序列CRE结合，从而启动基因转录［7］。CREB与CRE结合形成的复合物是多效性激活剂，参与多种细胞及病毒基因转录。目前已知引起神经元可塑性和适应性改变，参与药物依赖和耐受的mPer1［11，12］、nNOS［13］、CCK［14］和 fosB［15］基因等也受 CREB 调控。有研究认识到昼夜节律基因mPer1表达上调与药物依赖密切相关，应用核酶切割mPer1基因有效减轻吗啡戒断小鼠的戒断症状［12］。在体内应用NOS拮抗剂或反义寡核苷酸，阻断NO的产生，可有效减轻实验动物的吗啡依赖及耐受，故NO被认为参与了吗啡依赖和耐受［13］。CCK具有拮抗内源性阿片肽的作用，CCK-8是抗内源性阿片肽作用最强的神经肽，应用CCK-BR拮抗剂缓解大鼠吗啡戒断症状［14］。△FosB被认为是一种持续表达的分子开关，使急性药物反应逐步转化成相对稳定的适应状态，造成药物成瘾时长期的神经元和行为可塑性改变［10］。

本研究以CREB为靶点，体外合成CRE-decoy ODN，在证明了CRE-decoy ODN能选择性抑制慢性吗啡诱导的SK-N-SH细胞CREB的DNA结合活性升高、nNOS和fosB基因表达上调的基础上，进一步证实侧脑室单次注射20 μg CRE-decoy ODN可明显抑制吗啡戒断大鼠的戒断症状。由于已证明在培养的SKN-SH细胞内，CRE-decoy ODN与细胞作用48 h仍能以非整合形式在细胞内稳定存在，故我们选择在纳络酮注射前30 h行侧脑室注射CRE-decoy ODN，基于两方面的考虑:(1)使侧脑室注射损伤有一定的愈合时间，尽可能减低对行为学观察结果造成的影响;(2)保证有足够的CRE-decoy ODN能发挥作用。

在实验分组时中，设立侧脑室注射对照组，通过比较侧脑室注射对照组与0．9%氯化钠溶液对照组的实验结果，发现两者无差异。另外，通过脑组织灌注固定，肉眼观察，发现侧脑室注射未对周围脑组织造成明显破坏。故可基本排除侧脑室注射造成的损伤对实验结果可能产生的影响。

本研究证实，CRE-decoy ODN可降低吗啡戒断大鼠每15分钟内戒断症状的评分(1 h内)、1 h内戒断症状的总评分及体重丢失的戒断评分，为探寻阿片类物质依赖的干预措施提供了可靠的实验依据。

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