外源基因在苹果植株中稳定性研究

周瑞金，杜国强，师校欣

（1.河南科技学院园林学院，河南 新乡 453003；2.河北农业大学园艺学院，河北 保定 071001）

利用转基因进行作物改良开辟了作物育种的新途径，最大限度地绕过了物种间生殖隔离的障碍，使农作物获取整个生物界的遗传资源，大大缩短了育种的周期，但其能否成功关键在于外源基因在转化体内的遗传稳定性和表达情况。

转基因应用的实践表明，外源基因在受体中的命运受到一系列生理生化过程的作用，并以复杂的遗传方式表现出来，外源基因片段大小、甲基化、丢失、共抑制、基因沉默等都会影响其稳定遗传和表达[1－3]。

在植物组织培养过程中，培养材料继代时间越长遗传变异率越高。经过多代培养的转基因组培苗是否仍然保持原有品种的遗传性状，外源基因是否丢失，关系到转基因苗离体保存是否安全的问题。前人研究主要集中于普通组培苗继代培养的遗传稳定性[4－9]，对于转基因组培苗在继代培养过程中外源基因的稳定性研究较少。本试验对继代多代的转基因苹果组培苗中目的基因和报告基因的遗传和表达情况进行研究，为转基因作物离体的保存和应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为苹果（Malus domestica Borkh.）组培苗及转豇豆胰蛋白酶抑制剂基因（CpTI）苹果组培苗，品种为皇家嘎拉（Royal Gala）、王林（Orin）、乔纳金（Jonagold）和富士（Fuji），由河北农业大学园艺学院生物技术实验室培育。其中转基因品种皇家嘎拉46个株系编号为1～46；王林9个株系编号为47～55；乔纳金3个株系编号为56～58；富士2个株系编号为59～60。非转基因品种有：嘎拉（CK1）；王林（CK2）；乔纳金（CK3）；富士（CK4）。

转基因苹果组培苗采用常温继代保存。

培养条件：培养室温度（25±2）℃，光照时间16 h光照∶8 h黑暗，光照强度1 500～2 000 lx。继代培养基 MS+BA 0.5 mg·L－1+NAA 0.04 mg·L－1+白砂糖 30 g·L－1+琼脂 6.0 g·L－1，pH 5.8～6.0。每 8 周继代一次，培养保存6～8年。

1.2 方法

1.2.1 nptⅡ基因的检测

取常规继代培养6～8年的转CpTI基因苹果株系组培苗新梢，接入继代培养基MS+BA 0.5 mg·L－1+NAA 0.04 mg·L－1+白砂糖 30 g·L－1+琼脂 6.0 g·L－1+Kan50mg·L－1中，30d后观察新梢生长和白化情况。

1.2.2 外源CpTI基因的PCR检测

参照杜国强等提取苹果组培苗DNA的方法提取植物总DNA[10]，碱裂解法提取农杆菌质粒DNA[11]。PCR扩增分别以被检植物总DNA、阴性对照植物总DNA、阳性对照（质粒）DNA为模板进行PCR扩增反应。由CpTI基因序列设计引物1：5′GATGATGGTGCTAAAGGTGT 3′，引物 2：5′CTTACTCATCATCTTCATCC 3′。PCR 反应体系：20 μL 体系中含 TaqDNA 聚合酶 1.5 U，dNTPs 0.3 mmol·L－1，上游引物和下游引物各 0.25 μmol·L－1，Mg2+2.25 mmol·L－1，模板 DNA 40 ng，1×PCR 缓冲液，加灭菌超纯水使总体积为20 μL。

PCR扩增程序为：在94℃预变性6 min后，扩增35次循环，每循环包括94℃变性60 s，56℃退火90 s，72℃延伸90 s，最后一循环后72℃延伸10 min。扩增反应后，取各样品反应液5 μL，用1%的琼脂糖在100 V·cm－1条件下电泳检测，GD8000凝胶成像系统观测结果并照相。

1.2.3 总RNA提取

苹果组培苗总RNA提取用TRIzol一步法（大连TaKaRa公司），按试剂操作说明书进行。

1.2.4 mRNA反转录

按照Promega公司AMV mRNA逆转录试剂盒操作说明书进行。

1.2.5 RT－PCR 分析

PCR 反应体系：25 μL 反应体系：3 μL 20×稀释的逆转录产物，1 μL 引物 1，1 μL 引物 2，2 μL 25 mmol·L－1dNTPs，1.5 μL 25 mmol·L－1Mg2+，5 U TaqDNA聚合酶，2.5 μL 10×PCR缓冲液。PCR扩增条件：在94℃预变性2 min后，扩增30次循环，每循环包括94℃变性50 s，55℃退火50 s，72℃延伸100 s，最后一循环后72℃延伸10 min，4℃保温。扩增产物5 μL，用1%的琼脂糖在100 V·cm－1条件下电泳检测，GD8000凝胶成像系统观测结果并照相。

2 结果与分析

2.1 nptⅡ基因的卡那霉素抗性检测

nptⅡ标记基因可使转化植株产生对卡那霉素的抗性。苹果组培苗新梢在含有50 mg·L－1卡那霉素的继代培养基中生长30 d后，未转基因的对照组培苗叶片全部白化，转基因嘎拉、富士及乔纳金组培苗全部生长正常，未出现白化或花叶现象，而转基因王林中除转化株系48和49表现出新生叶片花叶现象外，其他株系生长正常（见图1）。说明标记基因nptⅡ在嘎拉、富士和乔纳金常规继代培养的转化株系中稳定存在并可以正常表达；而王林2个转化株系出现的花叶现象可能是因为nptⅡ酶表达量偏低所致。

2.2 外源CpTI基因的PCR检测

采集继代培养6～8年的转基因苹果组培苗的60个株系叶片，测定外源CpTI基因的存在情况。以CpTI基因的一对特异引物进行扩增，从60个株系中均可以得到一条均一的条带，片断大小约309 bp，而以非转基因苹果组培苗总DNA为模板扩增，没有检测到该特征带。

因此认为转基因苹果在组织培养条件下，常规继代培养6～8年后，外源CpTI基因在转基因植株中具有较强的稳定性。

2.3 RT-PCR检测外源基因在苹果组培苗中的表达

对外源CpTI基因在60个株系苹果组培苗中的表达进行RT－PCR检测，结果如下：48和49号2个株系没有得到309 bp的特异性目的片段，42～47、52、55～59等15个株系得到的309 bp特异性目的片段亮度暗，其余43个株系得到的目的片段明亮。表明外源CpTI基因在2个株系中mRNA未表达，43个转化株系中的mRNA水平表达强度较高，在其余转化株系中表达强度较弱。部分株系的苹果组培苗总RNA及RT－PCR电泳检测结果如图2、3所示。

图1 转基因苹果苗在含50 mg·L-1卡那霉素培养基上的生长情况Fig.1 Plant growth status of transgenic apple on medium containing 50 mg·L-1Kan

图2 部分苹果组培苗总RNA电泳Fig.2 Agarose gel electrophoresis of total RNA in apple cultured in vitro

图3 部分苹果组培苗RT-PCR电泳Fig.3 Agarose gel electrophoresis of RT-PCR in apple cultured in vitro

3 讨论

果树的遗传背景十分复杂，其体细胞突变不仅发生在田间状态，也广泛存在于组织与细胞培养中。一般认为变异频率为1%～3%[12]，但也有表型变异率高达90%的报道[5]。这种变异的发生对于保存含有外源目的基因的转化株系十分不利，可能会导致目的基因的沉默或丢失。前人研究表明，果树组培苗遗传稳定性受基因型、继代培养时期（继代次数）、培养条件如生长调节剂的应用等因素影响，如香蕉茎尖快繁后代存在一定比例的表现型变异，变异率随继代代数增加而增加，而杜国强等曾对不同继代次数（3～90代）的富士、金冠和乔纳金组培苗进行分析，认为其茎尖离体继代培养90次以内具有较高的遗传稳定性[7]。本试验对常规继代培养6～8年的60个苹果转化株系外源基因的检测结果表明，外源基因在苹果转化组培苗中具有较强的稳定性。

在许多情况下，外源基因在受体植株中的表达很不稳定，有的能正常表达，有的表达量很低甚至不表达，其表达与转基因的失活和沉默有关。在矮牵牛转苯基苯乙烯酮合成酶（Chalcone synthase，CHS）基因转化紫花矮牵牛以加深花色的研究中发现，高达42%的转基因当代植株产生白色或紫白相间的花朵，说明转基因和内源基因均被抑制，即基因不但没有高效表达，反而影响了内源基因的正常表达。在同一植物转化事件中，发生外源基因沉默的转化体占总数的3%～100%是一个较为普遍的现象[13]。本试验在卡那霉素抗性检测中有2个株系表现花叶，结合mRNA检测结果分析，造成这种现象的原因可能是因为外源基因或nptⅡ酶表达量偏低所致。而外源基因表达差异的原因可能是由于外源基因整合位点不同、基因沉默或基因的甲基化等，关于外源基因在不同株系间表达的机理还有待进一步研究。

4 结论

在60个常规继代培养6～8年的转CpTI基因苹果转化株系中均可检测出CpTI特异基因片段；除转化株系48和49在50 mg·L-1卡那霉素浓度下出现花叶现象，表现缺乏卡那霉素抗性外，其他株系在含相同浓度卡那霉素的培养基中生长正常。对60个转化株系苹果组培苗进行RT-PCR检测，转入的外源CpTI基因在43个转化株系中得到了较高水平的表达，分别为转化株系1～41、51和53；在42～47、52、55～59等15个转化株系中表达强度低，在转化株系48和49中未检测到特异表达条带。因此，转基因苹果在组织培养条件下，常规继代培养6～8年后，外源CpTI基因在转基因植株中可稳定存在，但外源基因表达不稳定，在不同株系间存在一定差异。

[1]Meyer P.Transcriptional transgene silencing and chromatin components[J].Plant Mol Biol,2000,43(2/3):221-234.

[2] Simon M C,Lopez M J J,Guo H S.Suppressor activity of potyviral and cumoviral infections in potyvirus－induced transgene silenceing[J].Gen Virol,2003,84:2877－2883.

[3] StempakJM,SohnKJ,ChiangEP.Cellandstageoftransformationspecific effects offolate deficiency on methionine cycle intermediates and DNA methylation in an in vitro model[J].Carcinogenesis,2005,6(5):981－990.

[4] 朱靖杰.香蕉组织培养中变异的发生与控制途径[J].果树学报,1995,12(2):120－122.

[5] 王正询,刘鸿先.香蕉苗试管繁殖染色体数量畸变的研究[J].遗传学报1997,24(6):550－560.

[6] 文晓鹏,邓秀新.利用细胞学和分子标记检测刺梨愈伤组织的遗传稳定性[J].果树学报,2003,20(6):467－470.

[7] 杜国强,师校欣,张庆良,等.苹果不同继代次数的茎尖组培苗同工酶酶谱及RAPD分析[J].园艺学报,2006,33(1):33－37.

[8] 张汉尧,刘小珍,周健,等.矮牵牛组织培养及变异苗的RAPD分析[J].广西植物,2006,26(1):74－75.

[9] 朱新霞,孙黎,陶春萍.甜瓜离体再生继代培养中玻璃化现象的研究[J].西北植物学报,2006,26(7):1468－1472.

[10] 杜国强,师校欣,马宝焜,等.一种适宜苹果组培苗的DNA提取方法[J].河北农业大学学报,1999,22(3):42－43.

[11] 黄培堂译.分子克隆实验指南[M].北京:科学出版社,2002.

[12] Skirvin R M,Mcpheeters K D,Norton M.Sources and frequency of somaclonal variation[J].Hort Sci,1994,29(11):1232－1237.

[13] Matzke M A,Moscone E A.Inheritance and expression of a transgene insert in an aneuploeid tobacco line[J].Molecular and General Genetics,1994,245:471－485.