P53和Ki-67蛋白在宫腔脱落细胞中的表达及意义

牛凤霞 贾利刚 张俊琴 张为霞 黄黛

子宫内膜癌是女性常见的恶性肿瘤之一，高发年龄为58～61岁，发生率占女性癌症总数的7%，占女性生殖道恶性肿瘤的20%～30%，近年来随着我国人均寿命的延长，饮食结构的改变，外源性激素治疗，子宫内膜癌发病率呈上升趋势，但有关子宫内膜癌发生的机制尚不明确，一旦发生转移及复发，愈后较差［1］。本文利用宫腔脱落细胞中细胞块，用免疫组化法检测正常子宫内膜、子宫内膜不典型增生、子宫内膜癌的P53蛋白表达，同时检测Ki-67在子宫内膜发生发展中的作用，提高子宫内膜癌的检出率。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2006年6月至2009年5月，我院妇科门诊患者108例，年龄35～78岁，平均年龄54.3岁;病例选择阴道不规则出血、绝经后出血、查体发现子宫内膜增厚等。其中子宫内膜癌32例，子宫内膜不典型增生36例，正常子宫内膜40例。

1.2 方法

1.2.1 取材方法:受检者取膀胱截石位，碘伏消毒宫颈，将子宫内膜细胞采集器在外套管的保护下，通过宫颈缓慢插入宫腔底部，读出宫腔深度，回缩外套管推出采集器，顺时针方向转动3～5圈，将外套管向前推将采集器收入外套管中，连同一起退出宫腔，将采集环上的附着物立即投入液基小瓶中，做成液基薄层细胞涂片进行观察，剩余液体制成蜡块。

1.2.2 标本处理:将液基保存液瓶中的剩余液体(最好有肉眼可见的漂浮物)，以1500 r/min离心10 min，弃上清。0.9%氯化钠溶液漂洗沉渣，以1000 r/min离心5 min，弃上清。加入4%甲醛，固定60 min，再以2000 r/min离心10 min，弃上清。加入60℃ 3%琼脂搅匀，2000 r/min离心10 min。取出琼脂块，常规脱水、石蜡包埋。

1.2.3 HE染色及免疫组化染色法:细胞块切成4 μm厚切片，常规HE染色，Ki-67、P53免疫组化染色，采用SP法，DAB显色，即用型鼠抗人Ki-67、P53单克隆抗体，即用型SP试剂盒。

1.2.4 结果判定:P53、Ki-67蛋白表达为光学显微镜下见细胞核内出现明确的棕黄色颗粒细胞为阳性细胞。结合半定量积分法［1］判断蛋白表达结果，按染色强度打分，0分为无色，1分为淡黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色，镜下选择10个高倍视野，计数100个细胞，计算其平均阳性百分率，根据平均阳性细胞的百分率分为4个等级，无阳性细胞为0分，阳性细胞≤10%为1分，≤50%为2分，≤75%为3分，＞75%为4分，染色强度与平均阳性细胞百分比的乘积＞3定为免疫反应阳性。

1.3 统计学分析 应用SPSS 11.0统计软件，计数资料采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

不同子宫内膜组织中P53的表达分别为正常子宫内膜7.5%(3/40)，子宫内膜不典型增生 52.78%(19/36)，子宫内膜癌87.5%(28/32)，3 组比较差异有统计学意义(χ2=46.67，P＜0.01)，Ki-67在正常子宫内膜、子宫内膜不典型增生和子宫内膜癌中的阳性表达分别为5.00%(2/40)、55.56%(20/36)、90.6%(29/32)，3 组间比较差异有统计学意义(χ2=53.8，P＜0.01)。

3 讨论

子宫内膜癌和宫颈癌是女性生殖道最常见的恶性肿瘤。而对宫颈癌的早期筛查、早期诊断、早期治疗已越来越受人们的重视，而且筛查方法也日趋完善，但对子宫内膜癌的筛查及早诊早治还没有引起人们的足够重视。往往临床上一经确诊绝大部分已是Ⅰ期、Ⅱ期，甚至Ⅲ期，愈后较差，本研究旨在寻求一种筛查子宫内膜癌，并利用免疫组化手段帮助诊断子宫内膜病变。

以往诊断子宫内膜癌最常用的方法是B型超声检查，对一些较典型的内膜癌声像图诊断较明确，表现为子宫增大或绝经后子宫相对增大，宫腔内见实质不均回声区，形态不规则，宫腔线消失，宫腔镜检查，可直视宫腔，若有癌灶生长能直接观察癌灶大小、生长部位、形态，并直视下取活检送病理检查。但最终靠诊刮术是最常用最可靠的方法，刮出组织送病理检查。但由于诊刮术的局限性，不是每个患者都能刮出组织，而且是有创的，操作较繁琐，痛苦大、出血多，患者不易接受，本研究使用的是子宫内膜采集器，具有价廉、简单易行、无痛、出血少、器具一次性使用无交叉感染，准确性高的特点，门诊大夫即可操作完成，特别是对一些有出血症状但内膜又较薄，做诊刮不易刮出组织的患者采取本方法弥补了这一不足。

P53基因蛋白是一种最常见的肿瘤抑制基因之一，野生型P53基因是通过停止细胞生长和诱导细胞凋亡而发挥其肿瘤抑制的功能，而突变型P53基因表达的蛋白可干扰野生型P53蛋白功能，因此突变型P53基因不仅丧失抑制活性反而具有促进恶性转化的活性细胞倾向与增殖、转化和癌变。P53基因蛋白已被广泛用于各种肿瘤的标记，但用来标记宫腔脱落细胞评价子宫内膜病变研究者甚少［2］。

TCT与细胞块技术已成为宫颈癌筛查的主要手段，但用于筛查子宫内膜癌研究者甚少，TCT标本制成细胞块后，能将刷取的细胞尽可能地收集在一起，纳入观察范围，细胞和细胞碎片经离心制成石蜡切片后有相当一部分可以形成组织学模式，在一定程度上可观察到组织的结构，经HE染色后，镜下接近组织学，背景清晰，细胞核浆更易观察，同时再加免疫组化技术又弥补了细胞学诊断的局限性，本研究显示，子宫内膜癌中P53蛋白的表达明显高于正常子宫内膜和子宫内膜不典型增生，且3组间差异有统计学意义(P＜0.05)，P53基因被认为是恶性肿瘤发生与发展的主要原因，有研究表明突变型P53蛋白半衰期较野生型P53蛋白长，能沉积在细胞核中，故突变的P53蛋白用免疫组化法可以检测出来，因此可以将检测率看做突变率，在一定程度上能预测内膜癌的恶性程度，及早发现子宫内膜癌或癌前病变。同时我们又检测了Ki-67蛋白的表达，Ki-67蛋白是反应细胞中增殖状态的指标，经研究已证实，在恶性肿瘤细胞中常呈高表达状态，其表达程度的高低反映了细胞增殖状态，广泛应用于评价肿瘤细胞的增殖活性，本文研究发现Ki-67在子宫内膜癌、子宫内膜不典型增生、正常子宫内膜中的表达分别为90.6%、55.6%、5.00%，3 组比较差异有统计学意义(P＜0.01)。在某种程度上反映了Ki-67的阳性表达强度与子宫内膜病变的严重程度呈正相关。

应用P53和Ki-67免疫组化染色有助于子宫内膜病变的准确诊断，可作为诊断子宫内膜病变的重要辅助指标。同时又弥补了脱落细胞学诊断的局限性，尽管本研究数据有限，尚需大样本研究证实，但毕竟为临床大夫提供了有效信息，指导患者随访和治疗，有望成为筛查子宫内膜癌的辅助手段。

1 邢小芬，李晓，乔书花，等.子宫内膜的内分泌细胞及其内分泌分化机制的探讨.河北医药，2010，32:3542-3544.

2 Caye-Thomasen P，Larsen K，T ingsgaard P，et al.Immunoh is tochem ical demons-tration and sem i-quantitation of vascular endothelial growth factor in recurrent versus non-recurrent nasal polyps.Acta Otolaryngol，2004，124:706.