苍耳甾醇类物质对小菜蛾的产卵及趋向行为选择的影响

周 琼，苏 旭，熊正燕，颜亨梅

(1.湖南师范大学生命科学学院，长沙 410081;2.中南林业科技大学林学院，长沙 410004)

昆虫的取食和产卵行为受多种因素影响，植物表面的化学因素 (包括挥发性和非挥发性的)和物理因素 (如颜色、表面形态结构等)直接影响昆虫对取食和产卵场所的选择及其产卵量 (钦俊德和王琛柱，2001;Jeffree，1986)。植物次生物质影响昆虫行为，并作为植物防御的重要物质是目前研究的热点之一 (Du and Yan，1994)。次生物质能够引起昆虫的负趋向和无定向移动，从而可避免或抑制昆虫取食和产卵 (Barbier，1976;Lungren，1975)。研究对昆虫取食和产卵有抑制效果的植物次生化学物质，并研制成昆虫行为调控剂，对环境安全，且作用方式多样，害虫不易产生抗性，是新一代害虫控制策略的发展方向 (孔垂华，2002;Pickett，1997)。

苍耳Xanthium sibiricum Patrin.属菊科苍耳属，是我国常见杂草，可作为中药材和土农药使用(侯海宫，2002;中国土农药编辑委员会，1959)。已有的研究显示，苍耳提取物及其不同分离物对多种害虫有较好的拒食、产卵忌避 (或忌避)和生长发育抑制效果 (周琼等，2005，2006，2007)，并已分离出倍半萜内酯类物质为是耳对昆虫的主要活性成分之一 (周琼等，2009;Kawazu et al.，1979)。在前期研究的基础上 (熊正燕等，2010)，我们对苍耳氯仿萃取物进行了进一步分离提纯，并测试了这些分离的结晶组分对小菜蛾的产卵和趋向行为选择的影响，为研究苍耳对小菜蛾的产卵忌避作用机制以及研制昆虫行为调控剂提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料来源

小菜蛾Xanthium sibiricum:由湖南省农业科学院植保所提供，在养虫室内用自行种植、未施任何农药的小白菜续代饲养，室温25℃，RH60%～70%。

苍耳:采自湖南省湘潭市郊。将新鲜苍耳叶及果实适当阴干后，50℃恒温烘干至脆，用植物试样粉碎机 (天津泰斯特仪器有限公司)粉碎，过40目筛。粉末放置于4℃冰箱中保存。

印楝素 (Azadirachtion)(含量≥90%):由湖南省化工研究院国家农药创制工程技术研究中心提供。

1.2 实验方法

1.2.1 苍耳活性组分的分离提纯

苍耳粉末用甲醇索氏提取后，氯仿萃取 (熊正燕等，2010)。取氯仿萃取物按一定比例的石油醚、氯仿、乙醚和丙酮梯度洗脱层析柱，经TLC板分析，将等分收集到的洗脱液中比移值Rf相同的馏分进行合并后旋转浓缩、生测，将活性高的组分进一步硅胶柱层析，如此进行多次，将分离提纯的馏分用甲醇和丙酮反复重结晶，将结晶称重后编号，4℃冰箱中保存待测。

1.2.2 对小菜蛾产卵量的影响

采用改进的叶碟法 (周琼等，2009)。苍耳各分离结晶组分和印楝素分别用丙酮溶解，用超纯水稀释至测试浓度 (0.1 mg/mL)，设相应浓度的丙酮水溶液为对照。接入新近羽化的小菜蛾成虫3～5对，实验设3次重复。分别于处理后24 h、48 h和72 h时观察统计每片叶碟上的落卵量。

1.2.3 对小菜蛾成虫趋向行为选择的影响

Y型管测试参照张志春等的方法 (2006)改进，测试在晚上18∶00～24∶00进行实验，保持室内温度25℃。将待测样品 (包括5个结晶组分和印楝素)用丙酮溶解为浓度0.02 mg/mL，滴加到大小为1 cm×2 cm的滤纸上，每张滤纸片滴加50 μL的样品，以等量的丙酮滤纸片作为对照，将处理和对照滤纸各放入Y型管两选择臂端部的膨部，在两臂的正上前方放置一15 W的白炽灯，作为微弱光源以吸引小菜蛾进入到Y型管臂内。测试时每次同时放入6头小菜蛾成虫，每处理重复6次。分别测试雄蛾、雌蛾的趋向选择。数据用T检验进行显著性差异分析。

1.2.4 苍耳样品的GC－MS分析条件

GC色谱条件:柱子:HP－5MS，30 m×0.25 mm×0.25 μm;进样口温度:250℃，分流比:50∶1;载气:氦气，流速:1.0 mL/min;采用程序升温，起温:80℃，升温速率:30℃/min，终温:280℃;160℃ 保留 3 min，汽化温度:250℃;离子源温度:230℃;四极杆温度:150℃。

MS分析条件:离子源:EI;电离电压70 eV，质量扫描范围40～800，电子倍增管电压1.2 kV。

1.3 数据统计处理

选择性产卵忌避率(%)=(对照组落卵量－处理组落卵量)/(对照组落卵量+处理组落卵量)×100。产卵忌避率数值越高，表示测试物质对试虫的忌避活性越强 (周琼等，2007)。

选择系数=选择处理臂的虫数/选择对照臂的虫数。当选择系数=1，表示测试物质对试虫无影响;选择系数＜1，表示试虫对测试物质有负趋向作用;选择系数＞1，表示试虫对测试物质有正趋向作用 (周琼，2004)。

利用SPSS软件的成对数据T检验进行差异显著性分析。

2 结果与分析

在活性追踪的基础上，苍耳氯仿萃取物经多次硅胶柱层析及重结晶，获得多个无色透明的结晶组分，取其中5个结晶组分 (分别编号为:Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ)用于小菜蛾成虫的产卵和行为选择测试。

2.1 苍耳不同结晶组分对小菜蛾的产卵的影响

苍耳结晶组分对小菜蛾落卵量的影响见表1，可以看出，在处理后24 h、48 h、72 h，结晶组分Ⅳ、结晶组分V和印楝素处理组的落卵量明显少于相应的对照组，两者之间差异达显著水平 (P＜0.05)甚至极显著水平 (P＜0.01)。其中，组分V对小菜蛾有明显的产卵忌避效果，处理后24 h、48 h和72 h的选择性产卵忌避率分别高达75.76%、85.45%、65.85%，甚至高于印楝素的活性 (后者分别为 61.29%、42.86% 和36.26%)，其次为组分Ⅳ (选择性产卵忌避率分别为42.10%、39.33%和47.65%)，组分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ产卵忌避活性不强或无产卵忌避活性。

表1 苍耳不同结晶组分对小菜蛾产卵忌避作用Table 1 Oviposition deterrent effect of components from X.sibiricum on P.xylostella in leaf disc choice bioassays

2.2 苍耳不同结晶组分对小菜蛾成虫趋向行为选择的影响

行为选择测试中，在所设定的时间仍停留在Y型管的处理臂和对照臂的记为有效，未选择者不计。结果见表2，可以看出，无论雌、雄性别，小菜蛾成虫进入结晶组分V和印楝素处理臂的虫数明显低于对照臂的虫数，处理臂与对照臂间的虫量差异均达到极显著水平 (P＜0.01);在结晶组分Ⅳ的测试中，小菜蛾在处理臂的虫量也少于对照臂，但显著性分析发现两者之间差异不显著 (P＞0.05);组分Ⅲ处理中，雌虫在处理臂和对照臂的虫量相同，但雄虫在处理臂的虫量少于对照臂，且两者之间差异显著 (P＜0.05)，说明组分Ⅲ对雌虫和雄虫的影响不同，对雌虫的选择无影响，但对雄虫的选择有影响，可减少雄虫的选择。

表2 小菜蛾成虫对苍耳不同结晶组分的选择Table 2 Choices of P.xylostella adults to diffrent fractions from X.sibiricum in Y-tube

图1 苍耳不同结晶分对小菜蛾成虫选择行为的影响Fig.1 Effect of different fractionts from X.sibiricum on chcices behavir of P.xylostella adults

小菜蛾成虫对苍耳不同结晶组分及印楝素的选择系数见图1，图中显示，小菜蛾成虫选择组分V和印楝素的系数最低 (雌雄分别为0.29、0.35和0.31、0.21)，负趋性最强;组分Ⅳ次之，选择系数分别为0.89和0.81;雌性小菜蛾成虫对组分Ⅲ的选择系数为1，表明小菜蛾雌虫对组分Ⅲ无趋性反应。值得一提的是，雄虫对组分Ⅲ的选择系数仅为0.53，说明其对雄虫有忌避效果。但经方差分析发现，苍耳的各结晶组分测试中，小菜蛾雌虫和雄虫的选择系数之间差异均不显著 (P＞0.05)，提示苍耳这些活性物质对小菜蛾成虫的作用效果，与小菜蛾的性别无明显相关。

2.3 苍耳结晶组分的GC-MS分析

对小菜蛾成虫产卵忌避和负趋向活性高的苍耳结晶组分Ⅳ和V进行GC－MS分析，结果发现两种结晶含有相似的化学成分，均以豆甾醇(Stigmasterol)和谷甾醇 (Gamma sitosterol)为主，另有极少量的菜油甾醇 (Campesterol)，但结晶组分V的豆甾醇含量 (51.8%)略高于谷甾醇(45.4%)，而结晶组分Ⅳ的豆甾醇含量 (40.0%)略低于谷甾醇 (56.7%)。

3 结论与讨论

植物甾醇是植物体中的一类天然活性甾类物质，广泛存在于各种植物油、坚果和植物种子中(盛漪等，2002)，小鼠的毒理实验表明植物甾醇属于实际无毒物 (张莉华，2010)，具有抗癌(Awad and Fink，2000)、调节免疫 (Bouic and Lamprecht，1999)等方面的功效。植物甾醇在植物抵抗许多不利因素 (生物的和非生物的)的过程中发挥重要作用 (张喜春等，2001)。关于植物甾醇对昆虫的作用报道的较少 (岑伊静等，2004;刘志茹等，2000;张国洲等，2000)。闫凤鸣(2003)认为植物产生蜕皮激素或结构相近的植物蜕皮甾类物质 (phytoecdysteroid)的生理功能可能与防御昆虫的取食有关。本研究结果说明苍耳甾醇类物质对小菜蛾成虫的产卵和行为选择有明显影响;同时，苍耳结晶组分V与Ⅳ的化学组成相似，均含谷甾醇、豆甾醇和少量的菜油甾醇，但对小菜蛾的活性却有一定差异，组分V的活性明显高于Ⅳ，提示植物甾醇不同成分或相同成分的不同比例组成对昆虫行为的影响有差异。

本研究使用Y管测试苍耳甾醇对小菜蛾的行为选择的影响，以弱光源作为引诱小菜蛾成虫的刺激源，成虫受光吸引随机进入两臂内，但到达处理臂膨部接触甾醇物质后选择回避离开，而进入对照臂中的试虫由于未接触甾醇物质受光吸引而选择留下，从而造成处理臂与对照臂之间虫量的差异，前者明显低于后者，测试结果与选择性产卵忌避实验的结果一致，即在产卵忌避实验中，产卵忌避率高的成分，在Y－型管测试中小菜蛾的选择系数也低，由于植物甾醇的分子量较大 (张喜春，2001)，提示近距离的嗅觉和接触化学感受器在小菜蛾的产卵行为中可能起重要作用，该结果与Justus and Mitchell(1996)一致。

魏辉等 (2002)研究显示小菜蛾的产卵忌避行为受触角、跗节和产卵器上的化学感觉器影响。通过分子生物学技术，张志春等 (2009)发现小菜蛾的化学感受蛋白 (CSP)不仅存在于小菜蛾的触角中，还存在于头、足、腹和翅中。本研究结果，苍耳甾醇物质对小菜蛾雌性和雄性成虫的行为选择影响差异不显著，提示小菜蛾对该类物质的化学感受器不存在或不仅仅存在于产卵器上。那么，苍耳甾醇类活性物质究竟是通过作用于小菜蛾哪些部位的化学感受器而引起小菜蛾的行为抑制，小菜蛾的化学感受机制如何?它们是如何协调控制，使小菜蛾表现产卵忌避行为的，尚待深入的研究。

References)

Awad AB，Fink CS，2000.Phytosterols as anticancer dietary components:evidence and mechanism of action.Journal of Nutrition，130(9):2127－2130.

Barbier，1976.Introduction to Chemical Ecology.Ferenczi M，ed，1979.London:Longman Press.

Bouic PJ，Lamprecht JH，1999.Plant sterols and sterolins:a review of their immune －modulating properties.Alternative Medicine Review，4(3):170－177.

Cen YJ，Pang XF，Ling B，Kong CH，2004.Study on the active components of oviposition repellency of Mikania micrantha H.B.K.against citrus red mite，Panonychus citri McGregor.Acta Ecologica Sinica，24(11):2542－2547.［岑伊静，庞雄飞，凌 冰，孔垂华.2004.薇苷菊提取物对桔全爪螨的产卵驱避作用及有效组分分析.生态学报，24(11):2542－2547］

China Traditionary Insecticides Editor Committee，1959.China Traditionery Insecticides.Peijing:China Sci.Press.165.［中国土农药编辑委员会.1959.中国土农药志.北京:科学出版社.165］

Du YJ，Yan FS，1994.The role of plant volatiles in tritrophic interactions among phytophagous insects，their host plants and natural enemies.Acta Entomologica Sinica，37(2):233－250.

Hou HG，Lu YT，Su YH，Xu PY，Zhang CX，Zeng JX，2002.Textual studies on Xanthium sibirium in ancient Chinese medicinal literatures.Chinese Traditional and Herbal Drugs，33(12):1128－1130.［侯海宫，吕益涛，苏耀海，徐培元，张彩霞，曾菊霞，2002.苍耳本草考证和药用文献考实.中草药，33(12):1128 －1130］

Jeffree CE，1986.The cuticle，epicuticular wax and trichomes of plants，with reference to their structure，functions and evolution.In:Insects and the Plant Surface.Juniper B，Southwood SR，eds.London:Edward Arnold Ltd，23－61.

Justus KA，Mitchell BK，1996.Oviposition site selection by the Diamondback Moth，Plutella xylostella(L.)(Lepidoptera:Plutellidae).Journal of Insect Behavior，9(6):887 －898.

Kawazu K，Nakajima S，Ariwa M，1979.Xanthumin and 8－epi－xanthantin as insect development inhibitors from Xanthium canadense Mill.Cell Molecular Life Science，35(10):1294 －1295.

Kong CH，2002.Frontier fields of plant chemical ecology in the 21st century.Chinese Journal of Applied Ecology，13(3) ∶349－353.［孔垂华，2002.二十一世纪的植物化学生态学前沿.应用生态学报，13(3)∶349－353］

Liu ZR，Hu YC，Ren FL，Zhang J，Mo JC，Wang WX，2000.Extraction，separation and bio－assay of Daphne genkwa active components.Journal of Central South Forestry University，20(4):15－19.［刘志茹，胡云楚，任风莲，张军，莫建初，王问学，2000.芫花杀虫活性组份的浸提、分离与生物测定.中南林学院学报，20(4):15－19］

Lungren L，1975.Natural plant chemicals acting as oviposition deterrents on cabbage butterflies［Pieris brassicae，P.rapae，P.napi］ .Zoological Science，4:253－258.

Pickett JA，Wadhams LJ，Woodcock CM，1997.Developing sustainable pest control from chemical ecology.Agriculture Ecosystems＆Enwronment Agriculture，Ecosystems and Environment，64:149 －156.

Qin JD，Wang CZ，2001.The relation of interaction between insects and plants to evolution.Acta Entomologica Sinica，44(3):360－365.［钦俊德，王琛柱，2001.论昆虫与植物的相互作用和进化的关系.昆虫学报，44(3):360－365］

Sheng Y，Hua W，Gu WY，2002.The distribution of phytosterol in food scources.Foods and Oils，(5):40－41.［盛漪，华伟，谷文英，2002.植物甾醇资源在食品原料中的分布.粮食与油脂，(5):40 －41］

Wei H，Hou YM，Yang G，You MS，2002.A primarily study on the sensilla mechanism concerning the oviposition deterrent of Plutella xylostella.Wuyi Science Journal，18(12):55－59.［魏 辉，侯有明，杨广，尤民生，2002.小菜蛾产卵忌避行为的化学感觉器机理的初步研究.武夷科学，18(12):55－59］

Xiong ZY，Zhou Q，Su X，2010.The antifeedant effect and enzyme activity of extract from Xanthium sibiricum on Pseudaletia Separate.Journal of Natural Science of Hunan Normal University，33(1):120－123.［熊正燕，周琼，苏旭，2010.苍耳氯仿萃取物对粘虫的拒食作用及酶活性的影响.湖南师范大学自然科学学报，33(1):120－123］

Yan FM，2003.Chemical Ecology.Beijing:Science Press.54.［闫凤鸣，2003.化学生态学.北京:科学技术出版社.54］

Zhang GZ，Wang WY，Xu HH，Wu GQ，Zhao SH，2000.Isolation and identification of extraction of Stellera chamaejasme(Ⅱ).Journal of Anhui Agricultural University，27(4):345－347.［张国洲，王亚维，徐汉虹，吴恭谦，赵善欢，2000.瑞香狼毒杀虫活性成分的提取与分离 (Ⅱ).安徽农业大学学报，27(4):345－347］

Zhang LH，Xu XD，Shao B，Ye SM，Hong YM，2010.Toxicological safety assessment of phytosterol.China Oils and Fats，35(5):19－22.［张莉华，许新德，邵斌，叶双明，洪毅敏，2010.植物甾醇毒理学安全性评价.中国油脂，35(5):19－22］

Zhang XC，Han ZH，ХоджайоваЛТ ЛутоваЛА，2001.Sterols biosynthesis and their physiological role in plants.Plant Physiology Communications，37(5):452－457.［张喜 春，韩振海，ХоджайоваЛТ ЛутоваЛА，2001. 植物体内甾醇的合成和生理作用.植物生理学通讯，37(5):452－457］

Zhang ZC，Wang MQ，Wang N，Li J，Zhang GA，2006.Olfactory responses of Plutella xylostellato polyamines.Acta Entomologica Sinica，49(1):142－145.［张志春，王满囤，王楠，李娟，张国安，2006.小菜蛾对多胺的嗅觉反应.昆虫学报，49(1):142 －145］

Zhang ZC，Wang MQ，Zhang GA，2009.Molecular cloning and expression characterization of a chemosensory protein gene PxylCSPl from the diamondback moth，Plutella xytostella(Lepidoptera:Plutelidae).Acta Entomological Sinica，52(2):140－146.［张志春，王满国，张国安.2009.小菜蛾化学感受蛋白基因的克隆和表达.昆虫学报，52(2):140－146］

Zhou Q，Liang GW，Kong CH，Huang SS，2004.Repellent effect of volatile oil from whitefly(Syngonium podophyllum)on aphids and its chemical constituents.Chinese Journal of Applied Ecology，15(5):856－858.［周琼，梁广文，孔垂华，黄寿山，2004.白蝴蝶挥发油对蚜虫的驱避作用及其化学成分.应用生态学报，15(5):856 －858］

Zhou Q，Liang GW，Zeng L，2005.Interferential effect of some plant extracts and pesticides on the growth and development of Myzus persicae and Lipaphis erysimi(Kaltenbach).China Vegetables，128(2):15－17.［周琼，梁广文，曾玲，2005.几种植物提取物和药剂对桃蚜和萝卜蚜生长发育的影响.中国蔬菜，128(2):15 －17］

Zhou Q，Liu BR，Shu YH，He Y，2006.Antifeedant and oviposition deterrent effect of extracts from Xanthium sibiricum and other medicinal plants against Plutella xylostella L.(Lepidoptera:Plutellidae)China Vegetables，(2):17－20.［周琼，刘炳荣，舒迎花，何艳，2006.苍耳等药用植物提取物对小菜蛾的拒食作用和产卵忌避效果.中国蔬菜，(2):17－20］

Zhou Q，Wei MC，Liu BR，Yan YC，Wang WX，2007.Antifeedant and deterrent activity of different extracts from Xanthium sibiricum Patrin against insect pests.Plant Protection，33(6):81－85.［周琼，魏美才，刘炳荣，晏毓晨，王问学，2007.苍耳不同分离物对害虫的拒食和忌避活性.植物保护，33(6):81－85］

Zhou Q，Wei MC，Ou XM，Zhong YH，Wang WX，2009.Antifeedant and deterrent effect of active fractions in Xanthium sibiricum leaf against insect pests and its chemical component.Journal of Plant Resources and Environment，18(1):74－79.［周琼，魏美才，欧晓明，钟义海，王问学，2009.苍耳活性组分对害虫的拒食和忌避作用及其化学成分.植物资源与环境学报，18(1):74－79］