汾酒酒醅发酵过程中有机酸的变化规律

曹云刚，马 丽，杜小威，张生万,*

(1.山西大学生命科学学院，山西 太原 030006；2.山西杏花村汾酒厂股份有限公司，山西 汾阳 032205)

汾酒酒醅发酵过程中有机酸的变化规律

曹云刚1，马 丽1，杜小威2，张生万1,*

(1.山西大学生命科学学院，山西 太原 030006；2.山西杏花村汾酒厂股份有限公司，山西 汾阳 032205)

采用气相色谱衍生化法和气相色谱-质谱分析法，跟踪考察汾酒发酵过程酒醅中有机酸的动态变化规律，同时利用酸度计和酸碱中和法考察酒醅pH值及总酸度随发酵时间的变化规律。结果发现：酒醅酸度随发酵的进行整体呈快速上升趋势，9～11d略有下降，发酵结束后酒醅pH值下降至3.3左右，总酸度升高了约25度；酒醅中有机酸以乳酸含量最高，占支配地位，乙酸含量次之，其含量均随发酵的进行整体呈上升趋势，在发酵后期乳酸含量为同期乙酸含量的10倍以上；各有机酸在酒醅中的质量比与在成品白酒中存在一定的差异。本研究提出缩短汾酒夏季大茬发酵时间为9d左右，并相应增加发酵轮次，以解决酸败问题并缩短发酵时间的理论设想。

酒醅；有机酸；衍生化；气相色谱；气相色谱-质谱；总酸度

白酒是我国特有的蒸馏酒，其酒质澄清透明，气味芳香纯正，入口绵甜爽净，与白兰地、威士忌等并称为世界七大蒸馏酒。白酒发酵过程与酒醅中微生物生长代谢紧密相关，随着发酵进行，酒醅中的微生物区系此消彼长，各种物质形态不断地产生和消失，通过复杂的物质能量代谢变化，生成了醇、醛、酸、酯等多种香味物质，进而形成了白酒特有的风味特征[1]。在成品白酒中，乙醇和水占其总质量的98%以上，这些香味物质所占比例不足2%，但它们的含量及比例却决定着白酒的风格、品质。

有机酸是白酒重要的呈味物质，能起到呈香、助香、减少刺激和缓冲平衡的作用，其含量高低及相互比例直接影响着白酒的风味和质量[2-5]。清香型白酒总酸含量一般在0.3～1.4g/L之间。酸量过少，则酒味寡淡，香弱味短；酸量过大，则酸味露头，酒味粗糙。汾酒的主体呈味酸类物质是乙酸和乳酸，两者占滴定总酸的99%以上，其中乙酸占滴定总酸的72%～82%；乙酸与乳酸的质量比在2.64～3.94之间，平均比值在3.3左右[2]。乙酸酸味刺激性强，适量能使白酒有爽快感，含量过高则呈刺激感；乳酸酸中带涩，适量能增加白酒的醇厚性，过多则呈涩味；丁酸有汗臭味，且对于清香型白酒来说就偏型了；己酸较丁酸柔和，但也有汗臭味等。有机酸作为相应酯类的前体物质，其含量及比例在很大程度上影响着相应酯类的量比关系。有机酸的含量直接决定着酒醅的酸度，从而在很大程度上影响着酒醅中微生物的生长代谢，进而影响到醇类、羰基化合物等的含量及比例。酸度过大是固态发酵夏季掉排、出酒率降低的重要原因[6]。因此，有机酸在发酵过程中的生成量及其相互间的量比关系，在很大程度上制约着酒醅发酵的好坏，进而影响白酒的品质。本实验采用60%乙醇提取酒醅中的有机酸，进行衍生化处理后，利用气相色谱-质谱联用和气相色谱衍生化法[7-15]进行定性、定量分析，跟踪考查汾酒发酵过程中有机酸随发酵时间的变化规律，同时利用酸度计测定法和酸碱中和法分别测定不同发酵时期酒醅的pH值和酸度，旨在为指导白酒生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

采集山西杏花村汾酒厂股份有限公司夏季正常大茬发酵地缸中距离表层30cm处不同发酵时期的酒醅，冷冻保藏备用；采样根据入缸发酵时间不同分别选取0、3、5、7、9、11、15、21、28、40d。

α-乙基正丁酸(内标，色谱纯) 北京化学试剂公司；10%四丁基-氢氧化铵水溶液(分析纯) 上海化学试剂有限公司；N,N-二甲基乙酰胺、溴乙烷(分析纯)成都市科龙化工试剂厂；无水乙醇(分析纯) 北京华腾化工有限公司。

1.2 仪器与设备

GC7890-5975C型气相色谱-质谱联用仪(配有Dean Switch装置) 美国Agilent公司；GC-2010型气相色谱仪 日本Shimadzu公司；PHS-4CT型台式精密pH计上海康仪仪器有限公司；BS124S型电子天平 德国Sartorius公司；SZCL型数显智能控温磁力搅拌器 巩义市英峪予华仪器厂；KQ3200DA型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酒醅中有机酸的提取

分别准确称取各时期酒醅样品10.0g置于100mL小烧杯中，加入60%的乙醇水溶液30mL，搅拌均匀后超声波辅助提取30min，转移至离心管中，5000r/min离心10min，取上清液，得酒醅有机酸提取液。

1.3.2 相关溶液的配制

内标液的配制：准确称取质量分数为99%的α-乙基正丁酸0.0487g置于10mL容量瓶中，用60%的乙醇定容，摇匀备用。

0.1 mol/L四丁基-氢氧化铵水溶液的配制：准确吸取质量分数为10%的四丁基-氢氧化铵水溶液12.974mL置于50mL容量瓶中，用蒸馏水定容，摇匀备用。

1.3.3 分析样品的制备[7-8]

准确称取不同发酵时期的酒醅有机酸提取液各一半，加入0.3mL按1.3.2节方法配制的α-乙基正丁酸内标液，用0.1mol/L四丁基-氢氧化铵水溶液中和至pH9.0，于沸水浴上蒸干；冷却后用5mL N,N-二甲基乙酰胺溶液分3次溶解剩余残渣，把溶液合并于一支具塞比色管中；用移液枪准确加入2倍中和时所消耗四丁基-氢氧化铵物质的量的溴乙烷，塞紧，摇匀；在室温下静置反应1h，取上清液1μL进行气相色谱-质谱分析。

1.4 色谱分析检测条件

1.4.1 气相色谱分析条件

色谱柱：SGE BP-21 FFAP柱(25m×0.32mm，0.25μm)；升温程序：45℃保持4min，以3.5℃/min升至230℃，保持20min；FID检测器与气化室温度均为250℃；载气(N2)流速1.0mL/min，氢气流速47.0mL/min，空气流速400.0mL/min；柱前压29.4kPa；进样量1μL，分流比45:1。

1.4.2 气相色谱-质谱分析条件

电子轰击(EI)离子源，电子能量70eV，离子源温度250℃，传输线温度280℃，四极杆温度150℃，质量扫描范围m/z 29～400。色谱柱：J&W HP-FFAP(30m× 0.25mm，0.25μm)；载气为氦气。升温程序、色谱条件同1.4.1节分析条件。

1.4.3 总酸度和pH值的测定

样品预处理：准确称取10.0g酒醅于250mL烧杯中，加入100mL煮沸冷却的蒸馏水搅拌10min，超声波处理15min后，5000r/min离心10min，取上清液于容量瓶中备用。

总酸度的测定[7]：准确吸取10mL上清液于锥形瓶中，加入20mL煮沸冷却的蒸馏水和2滴酚酞试剂，用0.1mol/L NaOH溶液滴定至微红色，10s不退色，记录消耗NaOH溶液的体积，平行滴定3次，取其平均值。总酸度定义[7]：100g酒醅滴定消耗氢氧化钠的毫摩尔数，以度表示。

pH值的测定：准确吸取20mL备用上清液于小烧杯中，用精密pH计测定。

2 结果与分析

2.1 酒醅中有机酸含量随发酵时间的变化规律

采用1.3.1节方法提取酒醅中的有机酸，衍生化处理后经气相色谱-质谱定性和气相色谱定量分析，考察汾酒发酵过程中有机酸含量的变化情况。上述方法不但排除了醇类、酯类等挥发性物质的干扰，而且能同时定量检测多种有机酸，特别是解决了直接进样法中甲酸在FID检测器上响应信号极小以及乳酸由于极性强在一般毛细管柱上不出峰的难题；与其他衍生化法相比该方法所用试剂溴乙烷更加安全，重氮甲烷酯化法所用重氮甲烷等试剂有剧毒，易爆，苄酯化法所用苄基溴是毒性催泪试剂[7]；此外，该方法简单、准确、重现性好，可满足白酒及发酵酒醅中有机酸含量的定量检测，便于工厂推广应用。不同发酵时期酒醅中有机酸的定性、定量分析结果如表1所示。

表1 汾酒发酵酒醅中有机酸成分的分析测定结果Table 1 Variation of organic acids in fermented grains during Fen liquor fermentation mg/g

由表1可见，汾酒大茬发酵过程中所检测的10种有机酸中，乳酸含量最高，在发酵后期达到了20mg/g左右，乙酸含量次之，在发酵后期达到了1.7mg/g左右，此时乳酸含量为乙酸含量的10倍以上。而在成品汾酒中，乙酸的含量要高于乳酸，这与它们自身的性质及固态发酵白酒特殊的蒸馏取酒方式有关，虽然在甑桶蒸馏过程中各有机酸的含量随蒸馏时间的延长总趋势是由少到多，但由于乙酸的挥发性很强而乳酸的挥发性相对较弱等原因使得流酒断花前乙酸的馏出量大于乳酸的馏出量。庚酸、辛酸、壬酸和癸酸在酒醅中都有检出，有些含量也并不太低，但在成品白酒中却含量极微，这主要是由于它们的沸点太高，达220℃以上的缘故。由于己酸的衍生化产物己酸乙酯与衍生化过程中所产生的四丁基溴化铵的峰重合未能定量检出。

乳酸的含量在0～21d内随发酵进行整体上呈快速增长趋势，9～11d有所下降，在第21天达到最大值23.6151mg/g，在21～40d内含量有所下降，但基本维持在20mg/g左右。甲酸的生成趋势与乳酸基本一致。乙酸的含量随发酵进行呈增长趋势，发酵前期增长较为缓慢，发酵中后期增长迅猛，在传统发酵结束(28d)后其含量达到1.7mg/g左右。丁酸以0.0457mg/g的含量入缸，在发酵第一周内含量变化不大，7～9d含量大幅度增长，9～11d有所下降，11～15d又大幅增长并达到最大值0.9670mg/g，此后随发酵进行呈下降趋势。壬酸和癸酸的生成趋势大体一致：0～9d含量快速上升，9～11d含量有所下降，11～15d含量又快速上升，此后随发酵进行含量逐渐下降。戊酸、异戊酸、庚酸和辛酸的变化趋势基本一致：0～7d含量大幅增长，7～11d含量大幅度下降，11～21d含量又快速增长，此后随发酵进行含量有所下降。

实验结果显示，大多数有机酸的含量在9～11d(有些为7～11d)呈下降趋势，这可能是因为此时微生物大量繁殖且生命活动旺盛所需碳源和能源物质供应不足，导致有机酸被消耗利用的缘故[16]；多数有机酸在发酵21d后含量呈下降趋势，可能与发酵后期酯化作用较强有关，这一现象有待进一步研究。

2.2 总酸度和pH值随发酵时间的变化规律

总酸度是指酒醅中所有酸性成分的总量，包括未解离酸的浓度和已解离酸的浓度；pH值反应的是酒醅的有效酸度，即酒醅中H+的活度[17](一般用浓度代替)。它们是非常重要的发酵参数，不仅在一定程度上反应了酒醅中微生物的生长代谢情况，而且影响着微生物的生长及代谢产物的形成[16]。因此，考查酒醅发酵过程中总酸和pH值的变化，对于了解酒醅中微生物的生长代谢、判断酒醅发酵好坏、指导白酒生产具有重要意义。不同发酵时期酒醅总酸度和pH值的测定结果如表2所示。

表2 不同发酵时期酒醅总酸度和pH值的测定结果Table 2 Variation of total acidity and pH value of fermented grains Fen liquor fermentation

由表2可见，随着发酵进行酒醅总酸度呈快速上升趋势，9～11d略有下降，可能是因为此时微生物大量繁殖所需能源和碳源物质不足，导致有机酸被消耗利用的缘故。酒醅入缸时总酸度为5.40，28d发酵结束时上升到30.67，在延长发酵期内持续上升，40d时达到32.50；相应地，pH值从入缸时的4.35下降到28d发酵结束时的3.37，在延长发酵期内持续下降，40d时下降到3.26。

酒醅的有效酸度与总酸度的变化趋势大体一致，但并不完全相同。在0～3d酒醅总酸度上升，pH值不但没有下降反而略有上升，15～21d酒醅总酸上升了约7度，但pH值基本没有变化。这是由于pH值的大小不仅取决于总酸中酸的性质与数量，而且还受所测样品中缓冲物质量及其缓冲能力大小的影响，由此可见pH值与其总酸度之间并没有严格的比例关系[17]。

在分析酒醅中有机酸随发酵时间变化规律的同时分析了其他香味成分随发酵时间的变化规律[18]，研究发现：1)酒醅中大多数醇类及酯类的变化趋势大体一致：发酵前期(0～7d或9d)含量快速上升，发酵中期(9～15d或21d)含量基本保持稳定，发酵后期含量又有所增长；2)大多数化合物在9d左右时的含量与其在21～28d时的含量相当；3)乳酸乙酯的含量随发酵进行持续而快速的增长，乙酸乙酯的含量在9d以后增加幅度很小，在发酵后期乳酸乙酯的含量约为乙酸乙酯的4～5倍；4)酒醅总酸度、有效酸度、乙酸和乳酸含量随发酵进行持续增长，发酵后期乳酸含量为乙酸含量的10倍以上。由于白酒的品质取决于其中各香味成分的含量及量比关系，清香型白酒的特征香味成分乙酸乙酯与乳酸乙酯的质量比一般在1.4～1.8，其主体呈味酸类乙酸和乳酸的质量比一般在2.64～3.94之间较为适宜[2]，因此综合考虑各种香味成分随发酵时间的变化规律及其对发酵过程和白酒品质的影响，在汾酒夏季生产过程中，若将大茬发酵时间缩短到9d左右，并相应增加发酵轮次，有望在保证汾酒品质和产量的前提下解决酸败问题。

3 结 论

3.1 酒醅总酸度随发酵进行整体上呈快速上升趋势，9～11d略有下降。发酵结束后酒醅pH值下降至3.3左右，总酸度升高了约25度。

3.2 酒醅中有机酸以乳酸含量最高，乙酸次之，在发酵后期乳酸含量为同时期乙酸含量的10倍以上，这与成品汾酒中含量相比有较大差异，成品汾酒中乙酸含量要高于乳酸，乙酸与乳酸的质量比一般在2.64～3.94之间。

3.3 汾酒夏季大茬发酵时间缩短为9d左右，并相应增加发酵轮次，用以解决酸败问题的理论设想是否可行，下一步需要在实际生产中验证。

3.4 综合考察酒醅发酵过程中各种香味成分的变化规律，同时研究相应微生物的生理生化特性，结合现代生物技术，是解决酸败问题、缩短发酵时间、提高白酒品质的有效途径。

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Variation of Organic Acids in Fermented Grains during Fermentation of Fen Liquor

CAO Yun-gang1，MA Li1，DU Xiao-wei2，ZHANG Sheng-wan1,*
(1. School of Life Science, Shanxi University, Taiyuan 030006, China；2. Shanxi Xinghuacun Fen Wine Factory Co. Ltd., Fenyang 032205, China)

The dynamic variation of organic acids in fermented grains during the fermentation of Fen liquor was monitored by derivatization followed by GC and GC-MS, together with that of pH measured using a pH meter and total acidity determined by acid-base neutralization titration. The results showed that total acidity of fermented grains generally displayed a rapid upward trend in the fermentation process except for a slight decline during days 9-11. pH of fermented grains was decreased to around 3.3 and total acidity was increased by 25 degrees after the fermentation. Among the identified organic acids in fermented grains, lactic acid showed the highest content and was dominant, followed by acetic acid, and both of them revealed a tendency to generally ascend in the whole fermentation process and their contents were over 10 times higher than that of acetic acid of the same time points at the late fermentation stage. The contents of the same organic acids in fermented grains and finished liquor were different. Based on this study, we posed a theoretical hypothesis that large-batch fermentation period in summer should be approximately 9 days and the number of fermentation batches should be increased, which is conducive to solving the spoilage problem and shortening fermentation period.

fermented grains；organic acid；derivatization；gas chromatography；gas chromatography-mass spectrometry；total acidity

TS262.3

A

1002-6630(2011)07-0229-04

2010-06-23

山西省回国留学人员科研项目(200902)；山西省科技创新计划项目(2007101016)

曹云刚(1985—)，男，硕士研究生，研究方向为食品化学。E-mail：200823104001@mail.sxu.cn

*通信作者：张生万(1955—)，男，教授，学士，研究方向为食品科学、化学计量学、药物合成。E-mail：zswan@sxu.edu.cn