梅迪-维斯纳病毒研究进展*

张念章,储岳峰,赵 萍,高鹏程,贺 英,逯忠新

(中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部草食动物疫病重点开放实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室,甘肃兰州730046)

梅迪-维斯纳病毒(Maedi-Visna virus,MVV)引起的梅迪-维斯纳病毒病(Maedi-Visna virus disease,MVD),也称绵羊进行性肺炎(Ovine progressive pneumonia,OPP)的病原体。本病在冰岛流行时,将表现为进行性间质性肺炎的症状描述为梅迪(Maedi,冰岛语,意为呼吸困难),将表现为麻痹性脑膜脑炎的症状描述为维斯纳(Visna,冰岛语,意为耗损)。近年的一些研究资料已经证实,梅迪和维斯纳是由同一种病毒感染引起的两种不同临床症状的疫病。乳腺是该病毒最为敏感的靶器官,即使在低敏感品种的羊中,乳腺也存在不同程度的病理学变化[1]。在自然情况下,发生MVV与朊病毒共感染时,可在肺和乳腺大量分离出该病原[2]。

一直以来,MVV被当作慢病毒属的模式生物来研究[3]。已被广泛应用于研究慢病毒属的细胞嗜性、持续性感染、发病机理[4]、传播途径[5]和免疫逃避[6]等方面。因此,本文对MVV病原分子生物学、致病机理、免疫逃避机理及引起宿主的免疫反应等进行综述,为研发新疫苗、药物以及防控该病提供理论依据。

1 病原

MVV又称绵羊进行性肺炎病毒(Ovine progressive pneumonia virus),直径大约90 nm～100 nm,呈球状体,属于C型粒子。病毒核心致密,直径为30 nm～40 nm。有囊膜,表面有长约10 nm的纤突,具有双层膜结构。核酸杂交研究表明,MVV与其他哺乳动物的慢病毒的核酸同源性很低。病毒粒子中的RNA不具有感染性。

1.1 病毒基因组

MVV的核酸基因组是由单股RNA组成,约占病毒干重的2%。1514冰岛株基因组全长有9 202个核苷酸,包含gag、pol和env 3个基因[7]。基因组单体RNA的结构自5′端甲基化帽子结构(m7GpppGmp)向3′端方向依次为5′端区末端重复序列(R)-5′端独特区(5′unique region,U5)-引物结合区(PBS)-前导序列(leader)-核心蛋白(Gag)编码区-病毒蛋白酶编码区(pol)-囊膜蛋白编码区(Env)-聚嘌呤段(PP)-3′端独特区(U3)-3′端区末端重复序列(R)-多聚A(polyA)。其中5′端和3′端的R区核苷酸序列完全相同,该序列在反转录过程中,与新合成的DNA从基因组的一端调至另一端有关;U5区长度约为70 nt,与反转录过程的起始、前病毒DNA的整合、病毒RNA的合成有关;leader区长度约为150 nt;3′端非编码区与结构区重叠。编码区中pol由3 315个核苷酸构成,和env的开放阅读框并不重叠,而由OrfQ(230个密码子)分开。

1.2 主要抗原蛋白

1.2.1 病毒的核心蛋白 Gag即病毒粒子的非糖结构蛋白,主要的抗原成分是p30,抗原性稳定。这些蛋白质的氨基酸序列在同属内的病毒间比较保守,具有相似的抗原性,为群抗原(group antigen,Gag)。Gag蛋白相应的基因为gag,gag基因的初始产物是含442个氨基酸的Gag前体蛋白,然后在病毒蛋白酶的作用下,裂解成基质蛋白(MA)、衣壳蛋白(CA)和核衣壳蛋白(NC)等。MA紧紧位于病毒囊膜之下,形成一个连续的蛋白质“壳层”,MA向内与其他Gag蛋白连接,向外与脂质双层的病毒囊膜相连,与结合脂质的特征相适应。在CA中还有一段长约20个氨基酸残基的高度保守区域,称为主要同源区域(MHC),针对MHC的抗体可与大多数反转录病毒反应。NC与病毒基因组RNA紧密结合,二者共同构成病毒的核心。将Gag核酸疫苗与佐剂IL-2联合免疫Balb/c小鼠。结果表明,免疫反应以特异性细胞免疫应答为主,同时可产生体液免疫[8]。

1.2.2 酶蛋白 主要包括蛋白酶(PR)、反转录酶(RT)、整合酶(IN)等3种。推测Gag-pol前体大约175 ku,2 177 bp至2 827 bp与反转录酶产生有关,4 163 bp至4 681 bp与核酸内切酶产生有关。病毒粒子的反转录酶是一个单链60 ku～70 ku蛋白,至少有四种不同活性。①它能以病毒RNA为模板合成DNA互补链;②它具有核酸酶活性(称为核酸酶H),去除DNA/RNA杂交分子中的RNA链;③它又能以DNA为模板合成另一条DNA链而成双链;④有整合酶活性。这种病毒的双链DNA称为前病毒。前病毒DNA整合细胞基因组后,在宿主细胞依赖DNA的RNA多聚酶Ⅱ的催化下,可转录成病毒正链RNA,即由整合在细胞染色体中的前病毒产生新的病毒粒子。Wu C等[9]预测了pol蛋白的CD8+的抗原表位,发现在多肽链的537位～725位氨基酸可形成25 aa的表位结构。Fu H L报道[10],琼脂糖凝胶柱层析纯化的MVV(K796株)经SDSPAGE分析,是由25种蛋白质组成的,最大的蛋白成分为gp175和gp115,最小的蛋白成分为p12。

1.2.3 囊膜蛋白 MVV的Env为糖蛋白,相应的基因为env,含983个密码子。具有抗原决定簇的是gp135,能诱发中和反应。蛋白质部分由二条肽链组成,较小的那条链贯穿病毒的囊膜,成为穿膜蛋白(TM),较大的那条链通过与二硫键和氢键与TM相连,暴露于囊膜之外,称为表面蛋白(SU)。二者均来自env基因编码前体的蛋白,经水解后产生。SU上有许多糖基化位点,这些位点在自然状态下结合有多糖;SU有受体结合的功能,但在一级结构上,组成受体结合的位点核苷酸并没有完全紧邻排列在一起。SU还是诱导宿主产生中和抗体的主要蛋白质。SU非常容易发生变异,是MVV抗原高度变异性的主要原因。TM也结合有多糖,但糖基化程度不及SU。TM有3个功能区,即膜外区、跨膜区和膜内区。膜外区与表面蛋白结合,其氨基端的氨基酸具有疏水性,参与感染过程中病毒与宿主细胞膜的融合。

2 致病机理

当病毒被吸入呼吸系统之后,即通过其囊膜糖蛋白吸附细胞表面受体而感染绵羊细胞,有时还可以侵入支气管、纵膈淋巴结、血液、脾和肾。被病毒侵袭的肺细胞、网状细胞或淋巴细胞,由于病毒刺激而增生。随后,肺泡间隔由于出现许多新的组织细胞和一些新的纤维细胞以及胶原纤维而变厚。同时肺泡壁的鳞状上皮细胞变成立方形细胞。此外,细支气管和血液周围的淋巴样组织增生形成活动性的生发中心。由于肺泡的功能减低甚至消失,气体交换受到影响,逐渐发展成致死型的缺氧症。有报道称,MVV的Tat蛋白可诱导山羊滑膜囊细胞产生细胞凋亡[11]。目前,已构建了可表达绿色荧光蛋白的MVV,为弄清其在体内感染的移行路线提供了有力工具[12]。

3 免疫逃避机理

尽管MVV感染后,绵羊很快就能产生特异性抗体,而且血清中还会存在高滴度的中和抗体和补体,但在长达数周至数月的潜伏期和症状出现的前期,各种组织包括脑、肝、心[13]、肺、精液[13]、鼻分泌物、粪便和外生殖器[14]中都存在低滴度的病毒。将病羊的血液接种于易感羊,照样可以引起人工感染。中和抗体似乎没有阻止病毒在血液中的传播,主要是由于该病毒感染单核-巨噬细胞后,大多数情况下不会对细胞造成任何伤害,而成为隐性感染[15]。

MVV RNA基因组可通过DNA前病毒的形式在血液单核细胞中复制,随血液循环至靶器官[16]。在血液中,MVV不被单核细胞递呈至细胞表面,也就不会被CD4细胞识别[17]。这种限制性表达使病毒能隐蔽循环,不能被宿主免疫系统识别,不会引起机体的免疫反应。当感染的单核细胞成熟为巨噬细胞后,前病毒基因的表达大为增加,以致用原位杂交即可检出病毒RNA,但产生完整病毒仍很少。病毒到达肺、乳房、关节和中枢神经系统组织后,在巨噬细胞表面的表达抗原,导致局部单核细胞炎性灶的产生。这种“特洛伊木马”式的机制,可以确保病毒在血液细胞的持续存在,细胞保护了病毒并可以释放病毒[18]。有研究用gag或gag与env重组基因工程疫苗免疫接种绵羊后,可减少前病毒在血液和组织中的存在。而单独使用env基因工程疫苗免疫接种绵羊,却无此作用[19]。说明gag在反转录过程中起到重要作用。此外,MVV可在体内发生抗原变异是持续性感染的另一种机制也已得到证实[20]。

4 机体免疫应答

关于本病进程缓慢的原因,目前尚无确切的解释。据Thormar等报道,若在培养液中加入健康羔羊血清,则能完全抑制MVV在单层细胞中的增殖,加入脑脊液也能产生类似的抑制效应。试验证明,这种抑制因子存在于所有被试羔羊的血清中,它不是免疫球蛋白,不能被透析或过滤,对100℃加热10 min有抵抗力,很可能是一种脂蛋白。在特异性抗体产生之前,这种因子可能在抑制病毒方面具有重要作用。这可部分地解释为什么OPP没有急性期。

关于MVV受体的研究,有采用病毒外表蛋白印迹法,检测能结合纯化病毒的细胞表面分子的分子质量。山羊滑膜炎(GSM)细胞和绵羊脉络丛(SCP)细胞表面约15、30、50 ku的分子与MVV结合。抗50 ku蛋白抗体可阻断35S-蛋氨酸标记MVV与SCP细胞结合。抗15 ku、30 ku蛋白抗体不能阻断病毒对细胞的结合。因此,通过抗50 ku蛋白抗体的阻断活性,可表明50 ku蛋白是MVV识别和结合靶细胞表面的分子。Mikula I等[21]研究发现,Toll样受体(Toll like receptors,TLRs)7与T LR8在MVV感染过程中起重要作用。

在绵羊感染MVV后,特异性细胞免疫可在感染后2周～3周内检出。补体结合抗体于7周至3个月内出现,中和抗体出现较晚,一般在3个月左右才能检出。p28抗体的出现时间及高峰期均早于p94抗体,且p28抗体的反应强度亦高于p94抗体。在血清阳性反应的绵羊体内,CD80和CD86的表达量与外周循环系统中Gag抗原的含量有关。而在显示临床症状的绵羊体内则无此关联[22]。

5 展望

目前,已报道的OPP的诊断方法包括胶体金免疫电镜、琼脂扩散试验[23]、ELISA、PCR[24]、半套式PCR、定量PCR[25]等,但是还没有针对梅迪-维斯纳病毒的生物制品。找到可以使病毒致弱的细胞株或实验动物,是研发疫苗的关键。另一方面,MVV在真核细胞中具有的反转录的特点,可以用来开发慢病毒载体,不但有利于研发疫苗,而且可以像噬菌体载体那样用在科学研究当中。相信随着分子生物学的进一步发展和科学技术的不断进步,MVV必将成为又一例可以预防的慢病毒。人类必将战胜HIV、MVV等慢病毒属致病病原,从而保护人类与动物的健康。

[1] 易海清,阿合买提°买买提,邓普辉,等.新疆卡拉库尔羊梅迪/维斯那病毒感染的病理学观察[J].动物医学进展,2006,27(2):75-78.

[2] Salazar E,Monleon E,Bolea R.Detection of PrPScin lung and mammary gland is favored by the presence of Visna/maedi virus lesions in naturally coinfected sheep[J].Vet Res,2010,41:58.

[3] Carey N,Dalziel R G.The biology of maedi-visna virus-an overview[J].Vet J,1993,149:437-454.

[4] Torsteinsdottir S,Andresdottir V,Arnarson H,et al.Immune response to Maedi-Visna virus[J].Frontiers Biosci,2007,2:1532-1543.

[5] Blacklaws B A,Berriatua E,To rsteinsdottir S,et al.T ransmission of small ruminant lentiviruses[J].Vet Microbiol,2004,101:199-208.

[6] Reina R,Berriatua E,Lujan L,et al.Prevention strategies against small ruminant lentiviruses:An update[J].Vet J,2009,182:31-37.

[7] Pépin M,Vitu C,Russo P,et al.Maedi-visna virus infection in sheep:a review[J].Vet Res,1998,29(3-4):341-67.

[8] 丁忠庆,沈荣显,相文华,等.IL-2和绵羊梅迪-维斯纳病病毒核心蛋白Gag核酸疫苗联合免疫小鼠的免疫应答[J].中国预防兽医学报,2007,29(3):204-207.

[9] Wu C,Barbezange C,McConnell I,et al.Mapping and characterization of visna/maedi virus cytotoxic T-lymphocyte epitopes[J].J Gen Virol,2008,89(10):2586-2596.

[10] Fu H L.Polyacry lamide gel electrophoresis of Visna virus polypeptides isolated by agarose gel chromatography[J].J Virol,1978,25(1):207-214.

[11] Angela R,Stphanie V,Tim G,et al.Small ruminant lentivirus T at protein induces apoptosis in caprine cells in vitro by the intrinsic pathway[J].Virology,2009,383:93-102.

[12] Gudmundsdttir H S,Olafsd ttir K,Franzd ttir S R,et al.Construction and characterization of an infectious molecular clone of maedi-visna virus that expresses green fluorescent protein[J].J Virol Methods,2010,168(12):98-102.

[13] Peterson K,Brinkhof J,Houwers D J,et al.Presence of prolentiviral DNA in male sexual organs and ejaculates of small ruminants[J].Theriogenology,2008,69(4):433-442.

[14] Cortez-Romero1 C,Fieni F,Russo P,et al.Presence of Maedi Visna virus(MV V)-proviral DNA in the genital tissues of naturally infected ewes[J].Reprod Dom Anim,Doi:10.1111/j:1439-0531.2010.01608x.2011,46(1):1-6.

[15] Thormar H.Maedi-visna virus and its relationship to human immunodeficiency virus[J].AIDS Rev,2005,7(4):233-45.[16] Andre′s D,Klein D,Watt N J,et al.Diagnostic tests for small ruminant lentiviruses[J].Vet Microb,2005,107:49-62.

[17] Ernst P,Reto Z,Giuseppe B.How to succeed as a virus:strategies for dealing with the immune sy stem[J].Vet Immu-nol,1999,72:111-117.

[18] Sipos W,Schmoll F,Wimmers K.Selection for disease and epidemic resistance in domestic ruminants and swine by indicator traits,marker and causal genes--a review.Part 2:Special immunogenetics of sheep and goats with particular regard for endoparasitoses,scrapie,foot rot and maedi-visna virus infection[J].Dtsch Tierarztl Wochenschr,2003,110(1):3-10.

[19] Niesallac H,Andrsa X,de Barbezangeb C,et al.Sy stemic DNA immunization against ovine lentivirus using particle-mediated epidermal delivery and modified vaccinia Ankara encoding the gag and/or env genes[J].Vaccine,2009,27:260-269.

[20] 李红芳,陈培富.影响持续感染的因素研究进展[J].动物医学进展,2008,29(5):86-90.

[21] Mikula I,Bhide M,Pasto rekova S,et al.Characterization of ovine TLR7 and T LR8 protein coding regions,detection of mutations and Maedi Visna virus infection[EB/OL].2010,doi:10.1016/j.vetimm,2010-06-15.

[22] Reina R,Glaria I,Benavides J,et al.Association of CD80 and CD86 expression levels with disease status of Visna/Maedi virus infected sheep[J].Viral Immunol,2007,20(4):609-622.

[23] Brellou G D,Angelopoulou K,Poutahidis T,et al.Detection of Maedi-visna virus in the liver and heart of naturally infected sheep[J].J Comp Path,2007,136:27-35.

[24] 胡建军,符子华,易 忠.绵羊进行性肺炎病原检测方法研究进展[J].动物医学进展,2007,28(8):68-72.

[25] Herrmann-Hoesing L M,White S N,Lewis G S,et al.Development and validation of an ovine progressive pneumonia virus quantitative PCR[J].Clin Vaccine Immunol,2007,4(10):1274-1278.