柴胡桂枝汤加味对大鼠抑郁模型行为学及海马区神经生长因子及脑源性神经营养因子表达的影响

葛鑫宇 陈宝田 林晓春 于 林 杜念念 (南方医科大学南方医院中医科，广东 广州 5055)

由于抑郁障碍具有高发病、高复发、高致残的特点，不仅给患者及家属生活质量带来影响，而且给社会及家庭造成沉重的经济负担。传统的三环类抗抑郁剂(TCA)和单胺氧化酶抑制剂(MAOⅠ)不良反应较大，且起效缓慢。新型抗抑郁药物5-HT再摄取抑制剂(SSRⅠ)副作用小，如舍曲林、帕罗西汀等，但仍有胃肠道及神经功能等不良反应〔1〕。本研究以柴胡桂枝汤加味和舍曲林对照观察大鼠抑郁模型行为学和神经生长因子(NGF)及脑源性神经营养因子(BDNF)的影响。

1 材料与方法

1.1 动物 清洁级健康雌性Wistar大鼠48只，鼠龄6～8 w，体重(200±20)g，由南方医科大学实验动物中心提供(scxk粤2006-0015)。按体重随机分为正常组、模型组、柴胡桂枝汤加味高、中、低剂量组、舍曲林组，每组8只。造模方法采用慢性中等强度应激刺激模型(CMU)〔2，3〕，包括以下几种不同的应激因子:光照(24 h)、禁食(24 h)、禁水(24 h)、拥挤(24 h)、孤养(24 h)、游泳(5 min)。每种刺激随机进行，使大鼠不能预料刺激的发生。造模时间为给药7 d后连续3 w。给药柴胡桂枝汤加味低、中、高剂量组分别给予浓度为29、58、116 g/ml柴胡桂枝汤加味药液;西药组给予舍曲林浓度为2.6 mg/ml混悬液。

1.2 药物 柴胡桂枝汤加味组成:柴胡24 g、黄芩10 g、党参10 g、半夏 10 g、生姜 10 g、大枣 10 g、甘草 10 g、桂枝 10 g、白芍20 g、生龙骨 30 g、生牡蛎 30 g、枣仁 15 g、远志 10 g、合欢皮20 g、夜交藤70 g。水煎两次，滤汁弃渣，合并药液，共煎出400 ml药液，含生药量290 g。将药液分别浓缩至浓度为29、58、116 g/ml冷藏备用。舍曲林(大连辉瑞制药有限公司，国药准字H10980141)用之前以双蒸水配制成2.6 mg/ml混悬液。

1.3 旷场试验(Open-field test)〔4〕观察 将大鼠单独置于高40 cm，底面边长为100 cm的方柱体内。底面用黑线平均划分为面积相等的25块方格。以动物穿越方格块数为水平活动等分，以站立次数为垂直得分。每只大鼠在给药第28天进行一次测定，每次5 min。

1.4 样品制备及测定 采用双抗体夹心ABC-ELⅠSA法，用抗大鼠NGF、BDNF单抗包被于酶标板上，标准品和样品中的大鼠NGF、BDNF与单抗结合，加入生物素化抗大鼠NGF、BDNF，形成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化物标记抗生蛋白链菌素与生物素结合，加入酶底物OPD，出现黄色，加终止液硫酸，颜色变深，492 nm处测OD值，大鼠NGF、BDNF浓度与OD值呈正比，可通过绘制标准曲线求出标本中大鼠NGF、BDNF的含量。BDNF试剂盒购自于南京斯倍恩科技有限公司。

2 结果

2.1 旷场试验得分 见表1。与正常组比较，模型组及各治疗组水平得分明显降低(P＜0.05，P＜0.001)，而各治疗组较模型组有所改善(P＜0.001)。与正常组比较，模型组垂直得分降低(P＜0.001)，其他治疗组较模型组有所改善(P＜0.001)。

2.2 海马内NGF与BDNF 见表2。与正常组比较，模型组NGF、BDNF水平明显降低(P＜0.001)，与模型组比较，西药组及柴胡中、高剂量组NGF和BDNF含量明显升高(P＜0.001，P ＜0.05)。与正常组比较:1)P＜0.05，2)P＜0.001;与模型组比较:3)P＜0.001

表1 各组大鼠行为学评分(n=8，±s)

表1 各组大鼠行为学评分(n=8，±s)

组别 水平得分 垂直得分柴胡桂枝汤加味低剂量组 51.88±10.8822) 11.88±3.2712)柴胡桂枝汤加味中剂量组 74.88±1.0512)3) 14.63±3.2921)柴胡桂枝汤加味高剂量组 98.38±14.5891)3) 18.75±2.9153)西药组 96.75±15.6551)3) 19.00±2.6193)模型组 45.63±12.8942) 11.13±3.9442)正常组116.38±27.563 19.25±5.874

表2 各组大鼠海马NGF和BDNF水平(n=8，±s，ng/ml)

表2 各组大鼠海马NGF和BDNF水平(n=8，±s，ng/ml)

与正常组比较:1)P＜0.001;与模型组比较:2)P＜0.001，3)P＜0.05

组别NGF BDNF柴胡桂枝汤加味低剂量组 259.00±24.5991) 17.58±4.3731)柴胡桂枝汤加味中剂量组 304.37±36.9443) 25.37±6.7021)3)柴胡桂枝汤加味高剂量组 310.25±53.3073) 37.97±5.2302)西药组 318.00±31.0483) 35.46±4.8032)模型组 221.12±47.6011) 18.32±6.1421)正常组337.87±52.015 40.38±7.951

3 讨论

抑郁症属于中医“郁症”范畴。古代医家有关郁症的论述分为两类，一是指一切人体气血津液等瘀滞不通而生的疾病，即气血津液之郁;二是专指情志抑悒忧郁的疾病，即情志之郁。而与抑郁症关系最密切的应为情志之郁。情志疾病的概念最早源于《内经》，认为人的精神意识、思维活动，以喜、怒、忧、思、悲、恐、惊七种情志变化为其表现形式。外有所触，则情有所变，内有所动。《内经》把情志因素看作导致人体致病的重要因素。认为七情五志的太过不及，特别是忧愁不解，直接影响脏腑功能的运转和气血津液的输化，甚则气机郁滞，产生病症。本试验选用小柴胡汤疏肝结郁，调节情志;桂枝白芍调和阴阳;佐以枣仁补肝、宁心安神，远志安神益智，合欢皮、夜交藤养心安神〔5，6〕。故临床上取得良好疗效。

本研究采用中等强度慢性应激方法建立大鼠抑郁模型，经行为学评分测定，证实该模型基本模拟了抑郁症患者的快感缺乏，兴趣缺失，精神运动迟滞等抑郁表现。柴胡桂枝汤加味高剂量组在旷场试验中水平得分和垂直得分较模型组有明显改善，且与舍曲林组无显著差异，证明该方有良好的抗抑郁作用。

海马是边缘系统重要组成部分，参与情绪、学习和记忆、行为、免疫等的调节，它的损伤在各种应激所致疾患中起到关键作用〔7〕。临床和临床前实验研究表明海马结构和功能的改变涉及抑郁症的病理生理学过程，功能性影像学研究提示抑郁症患者前额叶皮质、腹侧纹状体和海马的体积减少〔8〕。尸检表明抑郁症患者在前额叶皮质存在神经胶质细胞及神经元数目的显著减少，在海马亚区存在突触前标志物GABA能中间神经元的减少〔9〕。以上研究表明抑郁症患者与海马神经元细胞的丢失和海马体积的减少相关联。

NGF是第一个被发现、也是生物学功能了解得最清楚的一个神经营养因子。NGF对皮质、海马、基底前脑的胆碱能神经元有神经营养作用〔10〕。在成年大鼠脑内，神经生长因子蛋白含量最高的部位是海马，其次是皮质和嗅球;而NGF则广泛存在于全脑，在海马、新皮质和嗅球内NGF表达量最高〔11〕。

BDNF是神经营养素家族中的主要成员之一。研究资料表明BDNF与中枢神经系统神经元的生存以及多巴胺能、胆碱脂能、5-羟色胺能神经元的可塑性密切相关〔12〕。BDNF还可能通过对D3受体基因的表达调控，对神经元的增殖、分化和生存发挥作用，在神经精神疾病中起作用〔13〕。国内外的研究表明，即慢性应激的抑郁症模型鼠的大脑(尤其是海马)BDNF表达下调，经抗抑郁药处理能使BDNF表达水平上升。说明神经营养因子参与神经元的可塑性和存活性，可能涉及抑郁症的治疗机制之一。神经营养因子表达水平下降参与了抑郁症的某些病理生理过程，可能是抑郁症的基本病理改变之一。本研究表明提示柴胡桂枝汤加味改善大鼠海马内BDNF水平是治疗抑郁症的机制之一。

1 贾建平.神经科特色诊疗技术〔M〕.上海:科学技术文献出版社，2007:638.

2 Yan HC，Cao X，Das M，et al.Behavioral animal models of depression〔J〕.Neurosci Bull，2010;26(4):327-37.

3 Wu H H，Wang S.Strain differences in the chronic mild stress animal model of depression〔J〕.Behav Brain Res，2010;213(1):94-102.

4 Padilla E，Shumake J，Barrett DW，et al.Novelty-evoked activity in open field predicts susceptibility to helpless behavior〔J〕.Physiol Behav，2010;101(5):746-54.

5 吴海波，熊嘉玮，陈宝田.安神方对失眠大鼠中枢氨基酸类神经递质的影响〔J〕.热带医学杂志，2009;9(6):628-30.

6 赵智勇，耿慧春，姚 兵，等.柴胡桂枝汤抗抑郁作用的实验研究〔J〕. 中医药信息，2006;23(3):50-1.

7 Perry D，Hendler T，Shamay-Tsoory SG.Projecting memories:the role of the hippocampus in emotional mentalizing〔J〕.Neuroimage，2011;54(2):1669-76.

8 Niehusmann P，Seifert G，Clark K，et al.Coincidence detection and stress modulation of spike time-dependent long-term depression in the hippocampus〔J〕.J Neurosci，2010;30(18):6225-35.

9 Munoz A，Mendez P，Defelipe J，et al.Cation-chloride cotransporters and GABA-ergic innervation in the human epileptic hippocampus〔J〕.Epilepsia，2007;48(4):663-73.

10 Liu X，Wang D，Liu Y，et al.Neuronal-driven angiogenesis:role of NGF in retinal neovascularization in an oxygen-induced retinopathy model〔J〕. Ⅰnvest Ophthalmol Vis Sci，2010;51(7):3749-57.

11 Herrera DG，Maysinger D，Gadient R，et al.Spreading depression induces c-fos-like immunoreactivity and NGF mRNA in the rat cerebral cortex〔J〕.Brain Res，1993;602(1):99-103.

12 Klein AB，Trajkovska V，Erritzoe D，et al.Cerebral 5-HT(2A)receptor and serotonin transporter binding in humans are not affected by the val66met BDNF polymorphism status or blood BDNF levels〔J〕.JCereb Blood Flow Metab，2010;30(11):e1-7.

13 Sokoloff P，Leriche L.Drugs acting on D3 receptors in neuropsychiatric disorders:facts and prospects.Ⅰmplication for schizophrenia and its treatment in the regulation of BDNF-dependence on D3 receptor expression〔J〕.Encephale，2007;33(Pt 3):870-2.