荧光原位杂交技术在膀胱癌诊断中的临床应用

曹会彦 刘智明 乜国雁 章晓东 王国录 韩永刚 易文发 于 湧 朱明挺 李子刚

(青海省人民医院泌尿外科，青海 西宁 810007)

最近20年，随着对膀胱癌遗传学改变的深入研究，研究者发现膀胱癌的发生与3、7、17号染色体非整倍体改变及9号染色体 p16 位点缺失密切相关〔1，2〕。荧光原位杂交(FⅠSH)通过采用荧光标记的核酸探针可以检测染色体的变异。2007年卫生部医药卫生科技发展研究中心组织全国47家三级医院多中心、大规模探索中国人群在部分肿瘤的遗传学异常特点(其中包括膀胱癌)，研究FⅠSH检测在中国的可行性及科学性。我院作为青海省唯一参加单位，通过本课题探讨了FⅠSH技术在我省的应用前景，以期提高青海省尿路移行上皮癌的早期诊断率。我们于2007年10月至2009年4月应用FⅠSH检测20例正常人及91例疑似尿路移行上皮肿瘤患者的尿脱落细胞3、7、17号染色体及9p16区带的畸变情况，初步探讨FⅠSH在中国人群中诊断膀胱癌的作用。

1 资料与方法

1.1 临床资料 20例无肉眼血尿及其他泌尿系统疾病的正常对照组，年龄50～81岁，平均64.5岁。91例疑似尿路移行上皮肿瘤的肉眼血尿患者组，其中男性66例，年龄47～83岁，平均62.4岁，女性25例，年龄52～79岁，平均64.6岁。所有入选病例均签署知情同意书。

1.2 尿液留取及检测 每例患者均连续3 d留取晨尿200 ml，1 h内送检，一部分经离心后制备脱落细胞玻片，由指定的病理科医师进行细胞形态学检查，另一部分等待进行FⅠSH检测。健康人留取晨尿200 ml直接进行FⅠSH检测。

1.3 FⅠSH检测方法 本课题应用金菩嘉医疗科技有限公司提供的DNA FⅠSH探针。所用的FⅠSH探针包括GLP P16/GLP P17探针和CSP3/CSP7探针，荧光显微镜下均可见红色与绿色两种信号。GLP P16/GLP P17探针常见异常类型为P16缺失;17号染色体非整倍性，正常细胞应为2红/2绿，异常信号包括:1红/2绿、0红/2绿、2红/3绿、1红/3绿。CSP3/CSP7探针常见异常为3号及7号染色体非整倍性，正常细胞应为2红/2绿，异常信号包括:3红/2绿、2红/3绿、3红/3绿。

1.3.1 探针混合物准备及变性 室温下将7μl杂交缓冲液、1μl去离子水、2μl探针加入到微量离心管中，离心1～3 s。将装有10μl以上探针混合物的试管置于(73±1)℃水浴箱变性5 min之后，将该试管置于45℃ ～50℃水浴箱中，杂交前取出。探针准备好之后，玻片应置于45℃ ～50℃烤片机上预热。

1.3.2 探针与样本杂交 将10μl变性后的探针混合物滴于玻片杂交区域，立即加盖盖玻片，用橡皮胶封边。将玻片置于预热的湿盒中，42℃保温箱中过夜杂交。

1.3.3 玻片洗涤

1.3.3.1 洗涤液准备 室温下将50%甲酰胺/2×SSC溶液(A液)倒入三个分别标记“1”、“2”、“3”的考普林瓶中。使用前将盛有溶液的考普林瓶置于(46±1)℃水浴箱中至少30 min，使溶液达到所需温度。分别将50 ml 2×SSC溶液(B液)和2×SSC/0.1%NP洗液(C液)倒入考普林瓶中，使用前将盛有溶液的考普林瓶置于(46±1)℃水浴箱中至少30 min，使溶液达到所需温度。

1.3.3.2 洗涤程序 ①移去盖玻片，立即将玻片注意置于盛有50%甲酰胺/2×SSC溶液(A液)的瓶“1”中，晃动玻片1～3 s。按此重复另外几张玻片。②5～10 min后取出玻片。③将玻片置于盛有A液的瓶“2”中，晃动玻片1～3 s，5～10 min后取出玻片。④将玻片置于盛有A液的瓶“3”中，晃动玻片1～3 s，5～10 min后取出玻片。⑤将玻片置于盛有2×SSC溶液(B液)的瓶中，晃动玻片1～3 s，10 min后取出玻片。⑥将玻片置于盛有2×SSC/0.1%NP洗液(C液)的瓶中，晃动玻片1～3 s，5 min后取出玻片。⑦将玻片室温浸泡在70%乙醇中，3 min后取出玻片。

1.3.4 观察 ①暗处自然干燥玻片。②将5μl DAPⅠ复染剂滴加于杂交区域位置，立即盖上盖玻片。暗处放置10～20 min后，荧光显微镜下选用合适的滤波片组观察玻片。

1.4 统计学分析 采用χ2检验。

2 结果

2.1 诊断阈值的建立 20例正常人尿液，采用以上方法步骤制备玻片及进行FⅠSH实验，进行阈值测定。见表1。

表1 20例正常人尿液阈值

2.2 FⅠSH检测的结果 以膀胱镜和术后病理检查为诊断依据，91例行FⅠSH检测的患者，通过膀胱镜活检或手术后病理检查明确诊断为膀胱癌患者83例，泌尿系良性病变为8例。根据WHO分级法，其中16例为G1，48例为G2，19例为G3，根据TNM 分期系统，4例为 Ta，12例为 T1，34例为 T2，23例为 T3-4。

对91例行FⅠSH检测的患者对于肿瘤的敏感性和特异性进行分析，其敏感性为97.6%，特异性为92.9%。尿脱落细胞学的敏感性为43.4%，特异性为92.9%。FⅠSH与尿脱落细胞学在诊断膀胱癌中敏感性有统计学意义(P＜0.05)，特异性相近，无统计学意义(P＞0.05)。FⅠSH检测 G1、G2、G3级敏感性分别为 93.8%、97.9%、100%，Ta、T1、T2、T3-4各期的敏感度分别为75%、91.7%、100%、100%。尿脱落细胞学 G1、G2、G3级敏感性分别为 31.2%、37.5%、68.4%，Ta、T1、T2、T3-4各期的敏感度分别为0%、41.7%、55.9%、52.2%。

3 讨论

膀胱癌患者的诊断主要依靠膀胱镜及尿脱落细胞学检查，但膀胱镜检查为有创性，患者痛苦，难以接受，且对于肉眼见不到的肿瘤的诊断也存在困难;尿脱落细胞虽说特异性较高，但对低分级肿瘤的敏感性则较低，用于诊断膀胱癌及监测复发亦不理想，有报道尿脱落细胞学检测膀胱癌的敏感度为13%～75%，特异度为85% ～100%〔3〕。除尿脱落细胞学检查外，通过尿液的检查还有尿核基质蛋白22、膀胱肿瘤抗原、免疫-细胞检查法等方法，但这些检测方法敏感性和特异性均不十分理想。而检测尿液的端粒酶、透明质酸和透明质酸酶的方法其敏感性和特异性较好，但尚未经多中心的研究证实。

FⅠSH是一门新兴的分子细胞遗传学技术，目前这项技术已经广泛应用与动植物基因结构以及染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因进化研究等领域。FⅠSH采用荧光标记的DNA探针，根据探针与被检测样本中DNA序列的互补性，探针与DNA杂交后，在荧光显微镜下检测DNA序列在染色体或DNA纤维切片上的定性、定位、相对定量分析。技术本身相对简单，重复性好、稳定，并具有极有效的灵敏性和特异性。因此，FⅠSH很适应于临床医学检测。

本研究中我们使用了能标记3、7、17和9p16染色体的探针，应用FⅠSH技术，该方法灵敏度较为理想，特异度有待改进，考虑这与样本量较小有关，同时也与检测人员的镜下判断有关。应用FⅠSH技术进行遗传学改变的检测对膀胱癌(包括尿路上皮癌)的早期诊断及预后评估具有很大意义，其灵敏度高于细胞形态学检测，特异性则与细胞形态学相当(尿脱落细胞学检查对膀胱癌诊断的敏感性为43.4%，特异性为92.9%)，本研究中，FⅠSH出现2例假阴性，可能与肿瘤小、级别低、仅限于黏膜层致尿脱落细胞少或细胞尚未发生遗传学改变有关〔4〕。出现2例假阳性，也许并不能完全排除膀胱癌的可能，有报道11例膀胱镜检查阴性而FⅠSH检测阳性患者在3～12个月随访中发现7例膀胱癌〔5〕。说明虽然经膀胱镜检查阴性的患者，日后其患膀胱癌的风险仍很高，仍需密切随诊。

FⅠSH作为一种新兴技术在膀胱癌的早期诊断和预后评估中可代替膀胱镜及细胞学检查，具有无创、敏感性高及特异性强等优点，是早期诊断及监测膀胱癌较为理想的手段，并对于某些需要使用昂贵治疗方案的患者来说，在形态学检测的基础上再行FⅠSH检测可以更加明确疾病，减少患者因为误诊造成的不必要的费用支出及给患者造成的精神肉体痛苦。但因其探针相对价格较高，目前广泛应用于临床尚有一定的难度。随着此项技术的成熟及试剂成本的降低，相信FⅠSH技术在膀胱癌的早期诊断中将有着广泛的应用前景。

1 全国肿瘤防治研究办公室，卫生部统计信心中心.中国试点县、市恶性肿瘤的发病与死亡〔M〕.北京:中国医药科技出版社，2002:24-34.

2 Cianciulli AM，Leonardo C，Guadagni F，et al.Genetic instability in superficial bladder cancer and adjacent mucosa;an interphase cytogenetic study〔J〕.Hum Pathol，2003;34:214-21.

3 Bas WG，van Rhijin HG，van der Poel，et al.Urine markers for bladder cancer surveillance:a systematic review〔J〕.Eur Urol，2005;47(5):736-48.

4 Jose P，Blanca E，Marta S，et al.Clinical utility of a multiprobe FⅠSH assay in voided urine specimens for the detection of bladder cancer and its recurrences，compared with urinary cytology〔J〕.Eur Urol，2002;42(5):547-52.

5 Halling KC，King W，Sokolova ⅠA，et al.A comparison of cytology and fluorescence in situ hybridization for the detection of urothelial carcinoma〔J〕.JUrol，2000;164(5):1768-75.