鲜尽红,何 莉,汪正清
缺血性脑血管病的发病率、致残率和病死率都很高,严重危害人类的健康。大脑短暂缺血后,恢复血供时会触发一个强烈的炎症应答,引起脑组织继缺血后的第2次损伤,即脑缺血/再灌注(ischemia and reperfusion,I/R)损伤。兴奋氨基酸中毒、细胞内钙超载、自由基及其脂质过氧化、炎症反应等在脑缺血的病理生理过程中发挥着重要的作用。补体作为炎症反应的重要组成部分日益受到重视。研究认为,补体系统过度激活的炎症效应片段是脑内炎症反应损伤的主要始动因素之一[1、2]。脑I/R后补体系统被过度激活,导致白细胞大量聚集和激活,组织和血管严重损伤。虽然脑I/R损伤的发病机制还不十分明确,但许多实验研究已经证明补体级联反应与I/R损伤有直接关系。
1.1 脑内补体合成 一般认为,脑组织是免疫特惠区,血-脑脊液屏障将脑组织与血液分开,阻止了常规淋巴细胞再循环,限制了大分子物质进入脑实质和脑脊液。因此,很少或没有血浆成分进入脑组织。脑内补体主要由星形细胞合成。1987年Levi-Strauss首次证明了脑细胞能合成补体成分。近年来的研究表明[3],中枢神经系统内能够合成包括补体、补体调控分子及补体受体在内的完整的补体系统。人类星形细胞株在细胞因子的刺激下能表达和分泌补体的绝大部分成分,且星形细胞还能合成细胞因子,通过自分泌形式调控脑内补体合成。另外,脑血管内皮细胞、小胶质细胞、少突胶质细胞和神经元均有合成补体的功能[4]。这些研究结果表明脑组织可以合成完整的补体系统。
1.2 血液补体成分进入脑内 血-脑脊液屏障由脑内毛细血管和小胶质细胞结合的基膜细胞组成,具有一定的通透性。脑某些区域(如丘脑正中隆起、垂体、松果体和延髓最后区等)缺乏构成血-脑脊液屏障的血管内皮细胞层、基底膜和星形细胞终足,由有孔的毛细血管组成,其解剖特点决定血液中的补体成分可能在生理情况下进入脑内,但其非脑内补体的主要来源。动物实验表明,脑缺血后脑实质内存在补体成分,主要是由于脑血流减少时脑内毛细血管内皮细胞氧化损伤,血脑屏障通透性改变,血液中的补体向脑内渗漏所致;再灌注时进入脑实质的中性粒细胞、单核巨噬细胞也可合成补体。
正常情况下,脑内补体系统的激活和抑制处于平衡状态。补体通过3条途径激活,即经典途径、旁路途径和甘露糖结合凝集素(MBL)途径。生理情况下,脑内细胞(如星形细胞与小胶质细胞)能分泌抑制物,使脑内补体处于平衡状态。脑缺血时,缺血区pH值和离子浓度改变使细胞表面补体调节因子减少或缺失,导致C3/C5转化酶活性增高,补体激活增加,脑内毛细血管内皮细胞被破坏,引起MBL沉积,经MBL途径激活补体[5]。血浆与中枢神经系统内的抗原物质(如髓鞘等)接触,形成抗原抗体复合物,通过经典途径激活补体[6]。脑缺血变性坏死的组织细胞、变性的蛋白聚集物、受损组织释放的蛋白水解酶、缺血坏死后释放的亚细胞结构(如线粒体)、血肿液中的红细胞溶解等能经旁路途径直接激活补体[7]。旁路途径在I/R损伤中起重要作用,它是脑缺血时补体激活的重要放大机制。由此可见,脑I/R发生后,3种补体激活途径先后都被不同程度的激活,补体在脑内过度活化,导致微血管损伤和神经元细胞的凋亡[8]。
在脑I/R中,补体系统活化产物通过直接或间接的方式介导组织损伤。直接损伤是激活的补体固有成分作用的结果,间接损伤是由活化的补体成分触发的一系列中间反应造成的损伤[9]。
3.1 补体C1q C1q是补体经典激活途径的关键起始因子。研究人员制作小鼠的大脑中动脉闭塞(MCAO)模型,发现在I/R后,手术一侧的大脑皮层神经元在mRNA水平上表达C1q,而在对侧几乎看不到表达,实验对照组则完全没有表达。Van等[10]通过一个持续的MCAO模型,应用半定量逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法检测到缺血侧大脑皮层有C1qB和C4mRNA的表达,实验表明,中枢神经系统在缺血时能在系统内产生补体成分。同时作者认为,局部的补体激活可能促成了第2次脑损伤。
3.2 补体C3a和和补体C5a 补体激活产生大量过敏毒素C3a和C5a,促进肥大细胞和嗜碱性粒细胞释放炎症递质组胺,导致血管通透性增加,破坏血-脑脊液屏障;C3a和C5a还是有效的趋化因子,能够吸引白细胞聚集,大量白细胞在微血管内皮局部聚集,穿过内皮细胞,释放溶酶体酶,使组织蛋白水解,产生自由基和不饱和脂肪酸,引起脂质过氧化反应,破坏细胞膜结构和功能,破坏血-脑脊液屏障。Nishino等[11]建立了一个大鼠大脑I/R模型,用免疫组织化学染色的方法证明了在缺血再灌注1天和3天后脑缺血的核心区有补体成分C3和IgG的存在。由此,作者认为在短暂的缺血后,再灌注会引起血-脑脊液屏障的损伤,中枢神经系统对抗炎症的机制受到破坏。C3a和C5a还可引起巨噬细胞释放白细胞介素-1(IL-1)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、前列腺素和白细胞三烯,并上调黏附分子(ICAM)和E-选择素(E-selectin)。而TNF-α能增加基质金属蛋白酶的含量,可使单核细胞表达组织因子,从而激活凝血级联反应,并产生凝血酶,凝血酶在脑出血早期脑水肿发生过程中起重要作用。C5a与血管内皮细胞上的受体结合后产生氧自由基,损伤内皮细胞,也可产生弹性蛋白酶以扰乱内皮细胞间连接,改变血-脑脊液屏障的通透性,从而破坏屏障功能。体外研究证实,C5a对神经细胞凋亡起直接神经毒性作用,而脑出血后神经细胞凋亡又可加重继发性脑损害。
3.3 补体C5b-9(攻膜复体物)[C5b-9(MAC)] 再灌注损伤中补体的最后共同途径都是形成MAC。研究者提出,开始的局部缺血导致细胞丢失了在膜水平调节补体循环的能力,MAC在细胞膜上的沉积,最后会引起一系列急性缺血和血流较少的部位形成不可逆的损伤。此外,MAC在再灌注的上皮细胞内被发现,这可能是MAC导致了内皮细胞的损伤。亚溶解浓度的MAC可能启动血液的凝固和内皮的回缩,引起微血管衰竭和组织氧化损伤。MAC可直接插入细胞表面,形成双向亲水孔道,使Ca2+内流,细胞内电解质丢失,最终细胞发生渗透性溶解死亡。红细胞溶解后释放出血红蛋白,后者具有神经毒性,能引起脑水肿[12]。MAC可插入神经元、星形细胞和血管内皮细胞,导致神经元死亡和BBB破坏。MAC能破坏细胞膜,增加组织因子活性,从而激活外源性凝血途径,导致凝血酶产生增加。MAC还可沉积于细胞膜,使细胞分泌组胺、细胞间黏附分子-1、E-选择素、P-选择素和血小板活化因子等引起细胞膜渗透性增加和细胞水肿 ,破坏血-脑脊液屏障,还可直接激活单核细胞,导致细胞因子、活性氧自由基和金属基质蛋白酶等的产生,引起迟发性神经元死亡,加剧炎症反应。Casarsa等[13]将有溶细胞活性的MAC注入大鼠侧脑室,结果发现,注射6小时后大鼠脉络丛和脑膜血管白细胞渗出增多,细胞间黏附分子-1表达增加,脑脊液中性粒细胞趋化性蛋白-1和单核细胞趋化性蛋白-1水平增高,而且在脑室周围和脑脊液中发现IL-1表达。这说明MAC可通过多种途径导致炎症损伤。
通过大量的实验研究,越来越多的证据表明补体在大脑I/R损伤中起重要作用。因此,研究补体抑制剂以减轻I/R损伤,为临床治疗缺血性脑病带来了新的策略。针对补体的激活途径,目前补体抑制剂的研究主要有以下几大类。
4.1 补体受体Ⅰ型(omplement receptor type 1,CR1)分子是C3b/C4b的受体,是一种单链的膜结合糖蛋白,分布于多种细胞表面,由胞外区、跨膜区及胞内区组成。在人群中最常见的基因型为F的CR1胞外区由30个短同源重复序列(short consensus repeat,SCR)组成,每7个SCR为1组,构成4个长同源重复序列(LHRs)。LHR A中的前3个SCR组成有功能的位点Ⅰ,而LHR B和LHR C中的前3个SCR有3个氨基酸不同,但有相同的功能,都称为位点Ⅱ。LHR-A中有一个C4b结合位点,LHR-B和LHR-C有C3b结合位点。进一步研究证实[14],C4b的结合残基在SCR 1-3,C3b的结合残基在SCR8-10或15-17。可溶性补体受体Ⅰ型(sCR1)是CR1的胞外片段,功能性位点Ⅰ和位点Ⅱ都在 sCR1内。Huang等[15]建立小鼠大脑缺血再灌注模型,并在术前给予sCR1治疗。研究表明,在sCR1治疗组,小鼠的神经损伤显著减轻,中性粒细胞和血小板的聚集减少,梗死面积也有减小的趋势。它作为一个高效的补体抑制剂备受关注。
4.2 C5a单克隆抗体 抗C5a的单克隆抗体可以特异性地抑制C5裂解成C5a和C5b-9,阻止这些促炎反应递质的增加。在大鼠MCAO动物模型上显示[16],抗C5a单克隆抗体组较对照组脑梗死面积减小,水肿减轻,中性粒细胞聚集降低,并且运动的神经功能学评分明显提高。实验结果表明,抗C5a单克隆抗体能够减轻脑缺血再灌注引起的损伤。
4.3 C1酯酶抑制剂(C1-INH)C1-INH能共价结合补体经典激活途径的丝氨酸蛋白酶C1s、C1r,MBL途经中与丝氨酸蛋白酶1(MASP1)和丝氨酸蛋白酶2(MASP2)结合[17]。De Simoni等[18]在小鼠MCAO的模型上静脉给予C1-INH后对神经元有保护作用。在缺血48小时后,C1-INH能够明显减轻神经元丢失,梗死面积减少。中性红染色显示对大脑皮质、海马和纹状体都有很好的保护作用。用CD45的免疫组织化学染色显示,中性粒细胞浸润明显降低。以上显示C1-INH在防治脑缺血再灌注损伤中治疗价值。
4.4 眼镜蛇毒因子(cobra venom factor,CVF)CVF是一种来源于眼镜蛇毒性物质的抗补体蛋白,可与B因子结合形成稳定的C3/C5转化酶,导致补体被快速和持续地消耗[19]。实验发现,用CVF耗竭大鼠体内的补体后向其脑内注入自体动脉血,2小时后血肿周围脑组织TNF-α的产生减少,补体C3d、C5a、C9和中性粒细胞聚集的标志——髓过氧化物酶(MPO)阳性细胞数均减少,4、72小时后补体沉积较对照组明显减少,脑含水量显著减少。实验提示,CVF是一个潜在的可以非特异性地抑制补体减轻I/R损伤。
脑缺血再灌注后补体系统通过缺血后变性坏死的组织细胞等经旁路途径直接激活补体,但也可经经典和MBL途径不同程度地被激活。补体系统激活产物C3a、C4a、C5a和C5b-9等在脑缺血再灌注炎症损伤中起主要作用,其作用机制尚不完全清楚。目前抗补体的药物虽多,但尚无一种人工抑制补体制剂在特异性和有效性方面能满足临床应用的要求。所以,寻求新的的治疗策略是亟待攻克的重要课题。CR1、C1-INH等补体抑制剂具有较好的抑制补体效果,但距离真正应用到临床尚有一定的距离,其中还有不少的问题需要解决。但可以相信特异性补体抑制剂的研究将会为脑缺血再灌注损伤等多种相关性疾病的治疗提供一条新的途径。
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