树突状细胞的培养、鉴定及在移植中应用的研究进展

邹林洪综述,王豫蓉审校

(重庆医科大学附属口腔医院正畸科 400015)

树突状细胞(dendritic cell,DC)由Steinman和Cohn[1]于1973年首次在小鼠脾淋巴结中分离出来,因在体内成熟时细胞表面伸出树突样或伪足样突起而得名,是目前已知的专职抗原提呈细胞[2],能够激活初始T细胞。有研究表明DC在免疫应答中起着关键作用[3],在移植免疫中起着双向作用。一方面,DC向受体T细胞提呈供体抗原以及激活信号,诱导排斥反应的发生;另一方面,某些DC具有免疫调节作用,诱导机体对自体和外来抗原免疫耐受的发生。因此,利用DC的免疫调节作用诱导特异性的免疫耐受已成为当前移植领域的研究热点之一。Steinman和Banchereau[4]研究表明DC的免疫功能与细胞成熟与否有关,成熟DC启动免疫排斥反应,未成熟DC诱导免疫耐受。DC存在体内的部位较多,但数量有限,目前尚不能直接从组织中大量分离获得,需要进行培养扩增并纯化才能满足应用的需要。因此,如何培养获得大量且纯度更高的DC是进行各种研究的前提,是目前研究的重点之一。

目前,已能利用小鼠、大鼠和人的多种组织进行DC的体外培养,在基础实验中以小鼠和大鼠DC的培养研究最常见。现将对DC体外培养的取材来源、培养方法、鉴定方法及在器官移植中应用的研究进展综述如下。

1 DC培养的取材来源

1.1 小鼠

1.1.1 骨髓 最早开始用于体外培养DC的动物是小鼠。DC是由骨髓干细胞分化而来,因而用于培养小鼠DC的组织来源主要是骨髓,也是目前动物体外培养DC最常见的来源。骨髓中含有大量的CD34+造血干细胞,可在细胞因子的刺激下诱导产生一定数量及质量的DC。常采用的方法是取出小鼠四肢的股骨和胫骨[5],用RPMI-1640培养基冲洗出骨髓腔内的骨髓及髓内细胞,分离得到CD34+造血干细胞后进行诱导培养。

1.1.2 脾脏 1973年DC首次由 Steinman和Cohn[1]从小鼠脾脏中分离而来。他们先利用酶消化脾脏,再通过梯度密度离心过滤悬浮细胞,经过短时间贴壁后,培养过夜进行分离,可以得到一定数量的DC。Yao等[6]将小鼠脾脏消化培养获得了大于90%纯度和95%生存能力的DC。Huber等[7]也用小鼠脾脏成功培养出DC。

1.1.3 淋巴结 从各种淋巴结收集培养DC是另外一个获得DC有效的方法,Clare-Salzler和Mullen[8]将小鼠断颈处死,将淋巴结无菌分离,切碎制备细胞悬浮液,再进行分离培养,可以获得大量70%～90%纯度的DC。胰腺淋巴结(PLN)、腘窝引流淋巴结(PO-LNs)[9]、肠系膜淋巴结[10]均是小鼠DC培养的重要来源。

1.2 大鼠

1.2.1 骨髓 骨髓来源的DC是大鼠DC培养研究的重要途径。1982年Klinkert等[11]首次利用伴刀豆球蛋白A处理的脾细胞上清液来刺激低密度的大鼠骨髓前体细胞而获得大鼠骨髓来源的DC。此后,不断有研究报道成功从骨髓细胞培养获取大鼠骨髓来源DC,但是产量均较低。随着研究的深入,在利用重组大鼠GM-CSF的基础上联合应用重组大鼠IL-4和IL-10等细胞因子,使大鼠骨髓来源的DC的产量有了显著提高,现在每只大鼠可获得具有典型特征的 DC约1×107个,采用免疫分选法可使其纯度达90%以上。在实验研究中,其骨髓采集容易,易于培养、扩增,费用相对便宜。因此,从大鼠骨髓中分离诱导培养DC是许多学者主要的选择方法。

1.2.2 脾脏 脾脏是一个重要的免疫器官,DC在脾脏中参与调节免疫反应[12]。大鼠脾脏来源DC的收集培养同小鼠一样也多采取消化过滤的方法[13],可获得较高纯度的DC。大鼠的脾脏DC可以分为3种形态和表型不同的亚型:CD4+、CD4-、类浆细胞[14]。最近研究表明未培养过夜而分离的脾脏DC较按常规方法培养的DC表现出更多未成熟DC的典型特征[15]。

1.2.3 淋巴结 Matsuno等[16]直接通过周围淋巴结或中枢淋巴管收集DC,是在最接近生理条件状况下收集得到80%～90%纯度的DC,其生存能力达到95%以上,更具备DC本身的活性。

1.2.4 外周血 有研究指出DC的含量在大鼠外周血中小于0.1%[17],大鼠外周血DC的培养一般是采取大鼠的髂外静脉血进行培养。有报道指出脐带血和外周血来源的DC不能用于免疫正常动物的体内研究,而只能用于免疫缺陷动物的体内研究[18]。因而有学者建议用外周血来源的DC进行免疫缺陷的治疗,但这一特性也缩小了对外周血来源DC研究应用的范围。

1.3 人类

1.3.1 脐带血 脐带血是DC体外诱导培养的一个重要来源,是目前DC培养研究的热点之一[19-20]。脐带血一般用于对人类DC培养的相关研究[21]。脐带血中含有较多的CD34+造血干细胞,其来源广泛,培养相对方便,具有较好的组织相容性。常采取新生胎儿脐带血,离心后加入细胞因子定向诱导DC的生成。

1.3.2 外周血 大量的基础研究证实通过细胞因子可以将人类外周血单个核细胞进行分离诱导培养出DC[22]。外周血来源广泛,采集方法简单、方便,不易污染。但此方法存在以下缺点:(1)外周血中DC量相对骨髓中较少;(2)对实验人员的技术操作要求高,操作步骤相对较复杂,容易造成DC分离不纯、丢弃过多或混入较多的杂质。

2 DC的分离及培养方法

2.1 培养DC常用细胞因子的种类 目前用来诱导培养DC的细胞因子主要有粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素-10(IL-10)、白细胞介素-4(IL-4)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、γ干扰素(IFN-γ)、核因子-κ B(NF-κ B)圈套寡核苷酸,脂多糖(LPS)、转化生长因子β(TGF-β)等。细胞因子的单独或几种联合使用诱导扩增DC、是最常用的方法。其中GMCSF是最基本、最重要的细胞因子[23],有研究指出单独使用低剂量的GM-CSF即可以培养出未成熟的DC。根据培养要求的不同常在使用GM-CSF的基础上联合其他细胞因子进行培养,如 LPS、TNF-α、IFN-γ是比较常用的促DC 成熟的细胞因子,而 IL-4[24]、IL-10[25]、TGF-β[26]和 NF-κ B 圈套寡核苷酸则能抑制中性粒细胞和巨噬细胞等促炎性细胞因子的产生,维持DC处于未成熟状态。其中经IL-10处理的DC可致T细胞无能或凋亡,有报道称这些细胞可引起Th1向Th2的免疫偏离,TGF-β则不仅抑制DC成熟,还可增加DC的产量。这些细胞因子对DC的作用机制比较复杂,其效果与培养DC的组织来源和培养方法有密切的关系。

2.2 分离DC的方法

2.2.1 物理方法 亦称“培养黏附法”,是根据DC和单核细胞的黏附性、密度大小等的不同进行分离[15],培养一定时间后收集悬浮的细胞即为DC,DC纯度达60%～80%。由于“培养黏附法”方法简单,价格便宜,是目前最常用的获取DC的方法。“培养黏附法”最主要缺点是收集的DC常出现抗原标志的改变,容易造成部分DC前体细胞的丢失从而使产量减少,且纯度尚有待进一步提高。

2.2.2 免疫分选法 亦称“单抗法”,包括流式细胞术、磁性细胞分离术等,是以密度梯度离心法[27]配合以免疫磁珠清除法[28]或流式细胞术法,此法培养出的DC纯度可达90%以上。“单抗法”分离纯度高,可保持DC原有特征,一些要求较高的实验研究中常用“单抗法”来获取DC,但单抗消耗量大,价格昂贵,如果单抗选用不当,很容易造成部分DC丢失。

2.3 DC的培养方法 最常见的是先将DC的前体细胞分离出来,然后再在细胞因子的作用下诱导分化成为DC[21],但是这种方法由于受到前体细胞数量的限制,分离得到的DC数量有限。因此,有学者先对干细胞进行扩增后再诱导分化成DC。对脐带血通常采取“两步法”,首先选择重组人卵泡抑素(FST)、IL-3、IL-7、IL-13等从脐带血中将 CD34+造血干细胞中分离出,并将CD34+造血干细胞扩增至一定数量,然后再选择适当的细胞因子如用GM-CSF、IL-4等诱导培养[29-30],最终培育出大量成熟的或未成熟的DC。李纪鹏等[31]先利用CD34抗体将骨髓中CD34+细胞进行分离纯化及传代扩增,至第4代时加入GM-CSF、IL-4等诱导骨髓CD34+细胞向 DC分化,从而获得大量DC细胞。

3 DC的鉴定方法

3.1 DC形态学鉴定 (1)倒置相差显微镜下观察:根据培养方法的不同,培养后的细胞逐渐出现细胞集落,大部分贴壁,细胞逐渐增大而不规则,有树枝状的突起伸出,呈现出未成熟DC的特点。随着培养时间的延长细胞逐渐成熟,细胞从集落中释放出来,细胞呈悬浮或半贴壁生长,伪足逐渐生长,分叉逐渐增多[32]。(2)扫描电镜观察:根据培养方法及培养阶段的不同,主要表现为细胞形态不规则,表面粗糙,有皱褶和不规则突起,胞质内可见吞饮泡以及多泡体等特点。

3.2 DC表面特异性标记物鉴定 流式细胞学是目前应用最广泛的细胞鉴定术,DC的表型鉴定主要用流式细胞学进行分析。小鼠的表面特异性标志物主要是CD11c和共刺激因子MHC-Ⅱ、CD80、CD86等。大鼠的表面特殊标记物较少,目前较多的主要有 OX6、OX62和共刺激因子 MHC-Ⅱ、CD40、CD54、CD80、CD86等[33]。随着对大鼠DC生物学特性的深入研究发现,大鼠DC的表面标记物OX62的表达率高于OX6,因而近年来越来越多的学者将OX62作为表面特异性标记物来对大鼠DC进行研究。共刺激因子CD80、CD86、MHC-Ⅱ等表达的高低主要反应DC成熟度的高低,其表达越高说明DC细胞成熟度越高。

3.3 功能学鉴定 混合淋巴细胞反应是目前检测DC抗原提呈能力的重要方法,通过四甲基偶氮唑盐法检测混合淋巴细胞反应,计算淋巴细胞刺激指数(加刺激细胞的A值/不加刺激细胞的A值),刺激指数与DC/T细胞的比值呈正相关,随DC/T细胞的比值增大而增大[34]。

4 DC在器官移植中应用

近年来DC的应用得到许多学科的肯定[35],DC具有诱导免疫耐受的特性在诱导移植免疫耐受方面已经展现出独特的应用价值,在器官移植中得到了广泛应用,在心脏、肾脏、肝脏、小肠、胰腺、肢体移植等的报道较多,在角膜、皮肤、动脉、性腺、胰岛、喉、脾、肾上腺等器官移植中也有报道。研究结果指出将具有致耐受作用的DC输入受体体内能明显减低受体的免疫排斥作用,能够在一定程度上延长移植物或受体存活时间。

5 展 望

DC通过多种机制诱导免疫耐受或减轻同种异体免疫反应,在移植中展示出极强的可塑性已成为当前研究热点。目前人们对DC的研究尚处于初级阶段,现有实验尚停留在动物实验阶段,许多问题如DC诱导耐受的具体机制尚不完全清楚,细胞的类型和剂量、输注时间和时机、输注的途径等都有待进一步深入研究。提取高纯度的DC是进行各项研究的基础,虽然目前已能在体外培养并诱导产生DC,但依然存在不足,仍然有许多问题需要进行更深层次的研究。相信随着对DC的进一步研究和细胞生物学的进一步发展,培养出具有致耐受作用的DC,诱导移植免疫耐受的目的最终是有望实现的。

[1] Steinman RM,Cohn ZA.Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice.I.Morphology,quantitation,tissue distribution[J].J Exp Med,1973,137(5):1142-1162.

[2] Ricciaridi A,Elia AR,Cappello P,et al.T ranscriptome of hypoxic immature dendritic cells:modulation of chemokine/receptor expression[J].MolCancer Res,2008,6(2):175-185.

[3] Tamura Y,Teng A,Nozawa R,et al.Characterization of the immature dendritic cells and cytotoxic cells both expanded after activation of invariant NKT cells with alphgalactosylceramide in vivo[J].Biochem Biophys Res Commun,2008,369(2):485-492.

[4] Steinman RM,Banchereau J.Taking dendritic cells into medicine[J].Nature,2007,449(7161):419-426.

[5] Mossink MH,de Groot J,van Zon A,et al.Unimpaired dendritic cell functions in M VP/LRP knockout mice[J].Immunology,2003,110(1):58-65.

[6] Yao G,Yang L,Hou Y.Phenotype and functions of spleen dendritic cells in RICK-knockout mice[J].Int Immunopharmacol,2010,10(1):130-133.

[7] Huber C,Thielen C,Seeger H,et al.Lymphotoxin-beta receptor-dependent genes in lymph node and follicular dendritic cell transcriptomes[J].J Immunol,2005,174(9):5526-5536.

[8] Clare-Salzler M,Mullen Y.Marked dendritic cell-T cell cluster formation in the pancreatic lymph node of the non-obese diabetic mouse[J].Immunology,1992,76(3):478-484.

[9] Martin P,Ruiz SR,del Hoyo GM,et al.Dramatic increase in lymph node dendritic cell number during infection by the mouse mammary tumor virus occurs by a CD62L-dependent blood-borne DC recruitment[J].Blood,2002,99(4):1282-1288.

[10]Kusume A,Sasahira T,Luo Y,et al.Suppression of dendritic cells by HMGB1 is associated with lymph node metastasis of human colon cancer[J].Pathobiology,2009,76(4):155-162.

[11]Klinkert WE,LaBadie JH,Bowers WE.Accessory and stimulating properties of dendritic cells and macrophages isolated from various rat tissues[J].J Exp Med,1982,156(1):1-19.

[12]Yang L,Hou Y.Different characters of cpleen OX-62 positive dendritic cells between Fischer and Lewis rats[J].Cell M ol Immunol,2006,3(2):145-150.

[13]Zhu M,Wei MF,Liu F,et al.Interleukin-10 modified dendritic cells induce allo-hyporesponsiveness and prolong small intestine allograft survival[J].World J Gastroenterol,2003,9(11):2509-2512.

[14]Hubert FX,Voisine C,Louvet C,et al.Differential pattern recognition receptor expression but stereotyped responsiveness in rat spleen dendritic cell subsets[J].J Immunol,2006,177(2):1007-1016.

[15]Hibi M,Hachimura S,Ise W,et al.Dendritic Cells from Spleen,Mesenteric Lymph Node and Peyer＇s Patch Can Induce the Production of Both IL-4 and IFN-gamma from Primary Cultures of Naive CD4+T Cells in a Dose-Dependent M anner[J].Cytotechnology,2003,43(1-3):49-55.

[16]Matsuno K,Kudo S,Ezaki T,et al.Isolation of dendritic cells in the rat liver lymph[J].Transplantation,1995,60(7):765-768.

[17]Van Voorhis WC,Hair LS,Steinman RM,et al.Human dendritic cells.Enrichment and characterization from peripheral blood[J].J Exp Med,1982,155(4):1172-1187.

[18]翟妍,张震宇,乔宝丽,等.大鼠骨髓来源树突状细胞的分离与免疫学特征[J].吉林大学报:医学版,2007,33(6):952-955.

[19]Balan S,Kale VP,Limaye LS.A large number of mature and functional dendritic cells can be efficiently generated from umbilical cord blood-derived mononuclear cells by a simple two-step culture method[J].Transfusion,2010,50(11):2413-2423.

[20]Liu EM,Law HK,Lau YL.M ycobacterium bovis bacillus Calmette-Guerin treated human cord blood monocyte-derived dendritic cells polarize na ïve T cells into a tolerogenic phenotype in newborns[J].World J Pediatr,2010,6(2):132-140.

[21]Liu QL,Wang YS,Wang JX.Effect of growth hormone on the immune function of dendritic cells[J].Chin Med J(Engl),2010,123(8):1078-1083.

[22]Della-Bella S,Giannelli S,Taddeo A,et al.Application of six-color flow cytometry for the assessment of dendritic cell responses in whole blood assays[J].J Immunol Methods,2008,339(2):153-164.

[23]赵勇.移植免疫耐受[M].北京:中国医药科技出版社,2002:85-104.

[24]Lott DG,Dan O,Lu L,et al.Decoy NF-kappaB fortified immature dendritic cells maintain laryngeal allograft integrity and provide enhancement of regulatory T cells[J].Laryngoscope,2010,120(1):44-52.

[25]Li WM,Liu W,Gao C,et al.Antigen-specific tolerance induced by IL-10 gene modified immature dendritic cells in experimental autoimmune myocarditis in rats[J].Chin Med J(Engl),2006,119(26):1646-1652.

[26]Fan H,Wang J,Zhou X,et al.Induction of antigen-speci fic immune tolerance by TGF-β-induced CD4+Foxp3+regulatory T cells[J].Int J Clin Exp Med,2009,2(3):212-220.

[27]刘红耀,叶章群,庞东梓,等.F344大鼠树突状细胞的分离与培养[J].山西医药杂志,2005,34(5):362-364.

[28]贺伟峰,吴军,罗高兴,等.大鼠树突状细胞的体外分离、纯化、扩增及鉴定[J].第三军医大学学报,2002,24(8):879-881.

[29]M ytar B,Stec M,Weglarczyk K,et al.Biological activity of dendritic cells generated from cord blood CD34+hematopoietic progenitors in IL-7-and IL-13-conditioned cultures[J].Arch Immunol Ther Exp(Warsz),2009,57(1):67-74.

[30]Li L,M asucci MG,Levitsky V.Effect of interleukin-7 on the in vitro development and maturation of monocyte derived human dendritic cells[J].Scand J Immunol,2000,51(4):361-367.

[31]李纪鹏,黄怡,王为忠,等.大鼠未成熟树突状细胞体外扩增及功能鉴定[J].中国普通外科杂志,2007,16(9):859-863.

[32]王东海,李新钢,曲迅,等.Wistar大鼠树突状细胞的体外培养、扩增与鉴定[J].山东大学学报:医学版,2006,44(6):568-571.

[33]Banchereau J,Steinman,RM.Dendritic cells and the control of immunity[J].Nature,1998,392:245-252.

[34]侯利明,周保国,姜洪池.耐受性树突状细胞延长大鼠移植脾存活时间[J].中华器官移植杂志,2007,28(4):232-235.

[35]Keller AM,XiaoY,Peperzak V,et al.Costimulatory li gand CD70 allows induction of CD8+T-cell immunity by immature dendritic cells in a vaccination setting[J].Blood,2009,113(21):5167-5175.