嗜热链球菌谷氨酸脱羧酶基因及其侧翼区序列分析

林 谦，杨胜远，陆兆新，吕凤霞，别小妹，邹晓葵

嗜热链球菌谷氨酸脱羧酶基因及其侧翼区序列分析

林 谦1，杨胜远2，陆兆新3,*，吕凤霞3，别小妹3，邹晓葵3

(1.玉林师范学院化学生物系，广西 玉林 537000； 2.韩山师范学院生物系，广东 潮州 521041；3.南京农业大学食品科技学院，江苏 南京 210095)

从嗜热链球菌Streptococcus thermophilus Y-2的谷氨酸脱羧酶基因(gadB)及其两侧旁邻序列出发，在GenBank中分别用Blastn、Blastx搜索同源序列。gadB在核酸水平上无法找到同源序列，在蛋白质水平上与多种细菌的谷氨酸脱羧酶同源。根据谷氨酸脱羧酶的氨基酸序列构建系统发育树，菌株Y-2与具核梭杆菌Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum ATCC 10953的亲缘关系最近。gadB的上游侧翼区与嗜热链球菌LMG 18311的插入序列IS1216转座酶基因具有很高的相似性。gadB的下游侧翼区在核酸水平上未找到同源序列，在蛋白质水平上与谷氨酸/γ-氨基丁酸转运蛋白有很高的相似性。菌株Y-2的gadB、gadC排列方式与大肠杆菌、弗氏志贺菌的相同，而与乳酸乳球菌、短小乳杆菌的相反。在已完成全基因组测序的3个模式株Streptococcus thermophilus LMG 18311、CNRZ1066、LMD-9中均含有插入序列 IS1216，但未发现谷氨酸脱羧酶基因gadB、谷氨酸/γ-氨基丁酸转运蛋白基因gadC。

嗜热链球菌；谷氨酸脱羧酶；γ-氨基丁酸；序列分析

谷氨酸脱羧酶(EC 4.1.1.15)在动物、植物、微生物中广泛存在，催化谷氨酸的α-脱羧反应，生成γ-氨基丁酸(GABA)，是生物体内合成γ-氨基丁酸的关键酶。γ-氨基丁酸作为哺乳动物中枢神经系统一种主要的抑制性神经递质，具有降血压、延缓神经细胞衰老、治疗精神疾病、抗焦虑等多种重要的生理功能，在医药、食品保健、化工、农业等行业有广泛的应用[1]。

利用食品级微生物尤其是乳酸菌生产富含γ-氨基丁酸的保健食品具有独特的优势，近年来受到国内外的重视。目前已有多种乳酸菌的谷氨酸脱羧酶基因被克隆[2-4]，对谷氨酸脱羧酶基因的研究与改造是提高乳酸菌γ-氨基丁酸产量的有效手段。嗜热链球菌是乳品发酵工业中重要的乳酸菌，全球每年消费的嗜热链球菌乳制品市场价值约为400亿美元，被人类食用的活菌数目估计达1021[5]。嗜热链球菌虽然已有3个菌株完成了全基因组序列分析[5-6]，但谷氨酸脱羧酶基因(gadB)只在Y-2菌株中发现[7]，关于该基因的详细分析尚没有其他文献资料。

本实验拟对嗜热链球菌Y-2菌株的谷氨酸脱羧酶基因及侧翼区序列进行分析，以期为深入了解其γ-氨基丁酸的生物合成机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌株

嗜热链球菌Y-2菌株为南京农业大学食品科技学院酶工程实验室筛选并保藏的乳酸菌，有较高的谷氨酸脱羧酶活力[7-9]。

1.2 方法

嗜热链球菌Y-2谷氨酸脱羧酶基因及侧翼序列在前期工作中已被克隆并测序[10]，在GenBank中的登录号为DQ871217，其中294～1673区域为谷氨酸脱羧酶基因gadB。

信号肽分析采用SignalP软件 (http://www.cbs.dtu.dk/ services/SignalP/)。启动子预测工具为 http://www.fruitfly. org/seq_tools/promoter.html。

保守结构域搜索采用NCBI的CDD数据库及在线分析工具http://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan。

核酸对核酸的搜索程序用Blastn，核酸对蛋白质的搜索程序用Blastx。系统发育树分析采用ClustalX 1.83与MEGA 4软件，算法选择邻近相连法(Neighborjoining)，Bootstrap重复次数设为1000。

2 结果与分析

2.1 信号肽序列及启动子分析

对谷氨酸脱羧酶用SignalP软件分析，结果表明该酶不存在信号肽，与其他细菌的谷氨酸脱羧酶相同。gadB基因上游侧翼序列预测结果如图1所示。有两段序列(214～259，231～276)的分值达0.99，超过了0.8，很可能是启动子。至于是哪一个或者两个序列都能驱动谷氨酸脱羧酶基因的表达，有待进一步研究。

图1 启动子预测结果Fig.1 Promoter prediction result

2.2 谷氨酸脱羧酶保守域

将Y-2菌株谷氨酸脱羧酶序列在NCBI保守结构域数据库CDD中搜索，其29～379位氨基酸序列片段形成一个依赖于磷酸吡哆醛的脱羧酶保守结构域(pfam00282)。在线网站工具http://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan的分析结果表明26～362或26～377区域是依赖于磷酸吡哆醛的脱羧酶保守域，与CDD中搜索的结果一致。

2.3 谷氨酸脱羧酶系统发育分析

以菌株Y-2的谷氨酸脱羧酶基因序列在GenBank中搜索，程序为Blastn，E值为10，结果没有搜索到任何相似序列。改用Blastp程序，以谷氨酸脱羧酶的氨基酸序列搜索，搜索到多个细菌的谷氨酸脱羧酶。与菌株Y-2的谷氨酸脱羧酶的氨基酸序列相似度最高的为梭形杆菌属(84%)及双歧杆菌属的几个菌株(82%～83%)，而与乳酸乳球菌IL1403、罗伊氏乳杆菌的相似度为68%；虽然肺炎链球菌与嗜热链球菌同属，然而二者的谷氨酸脱羧酶的氨基酸序列却没有同源关系，肺炎链球菌的谷氨酸脱羧酶与人类的相似度极高[11]。

根据多种细菌的谷氨酸脱羧酶序列，构建了系统发育树。从图2可以看出，具核梭杆菌ATCC 10953与菌株Y-2位于同一个分支内，与该分支最近的是双歧杆菌属。

2.4 gadB基因上游侧翼序列分析

将gadB基因上游侧翼序列在GenBank中搜索，程序选择Blastn，在几种乳酸菌中找到同源序列。相似度最高的是嗜热链球菌S. thermophilus LMD-9、CNRZ1066、LMG18311，在乳酸乳球菌Lactococcus lactis subsp. cremoris SK11，肠球菌Enterococcus中也可找到同源序列。为了研究该段序列的可能表达产物，改用Blastx搜索，结果如图3所示。gadB基因上游侧翼序列的编码产物与多种细菌的转座酶具有同源性。相似度最高的是单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes str. 4b H7858)的一个蛋白，其次是嗜热链球菌CNRZ1066、LMG18311的插入序列IS1216的转座酶，与其他细菌的转座酶也有较高的相似性。由此推断，gadB基因上游很可能是一个转座酶基因，这个转座酶在多种细菌(Streptococcus thermophilus，Carnobacterium，Enterococcus faecalis)中比较保守。搜索，结果如图4所示：具核梭杆菌Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum ATCC10953的谷氨酸/ γ-氨基丁酸逆向转运蛋白与菌株Y-2 gadB基因下游侧翼序列的编码产物相似度最高，其次是几种双歧杆菌的功能未知蛋白以及其他细菌的谷氨酸/γ-氨基丁酸逆向转运蛋白。由此可以推断菌株Y-2的gadB基因下游是编码谷氨酸/γ-氨基丁酸逆向转运蛋白的基因。其他细菌的谷氨酸/γ-氨基丁酸逆向转运蛋白的基因一般命名为gadC，本研究也依照这个惯例。

图3 谷氨酸脱羧酶基因上游侧翼序列的Blastx搜索结果Fig.3 Blastx result of glutamate decarboxylase gene upstream flanking sequence

2.6 gadB基因及其侧翼区的组织结构

根据序列分析的结果，推测gadB基因及其侧翼区的组织结构见图5，谷氨酸脱羧酶基因gadB及侧翼区的核苷酸序列见图6。

图5 gadB基因及其侧翼序列的组织结构Fig.5 Putative organization of gadB gene and flanking sequences

2.5 gadB基因下游侧翼序列分析

图4 谷氨酸脱羧酶基因下游侧翼序列的Blastx搜索结果Fig.4 Blastx result of glutamate decarboxylase gene downstream flanking sequence

将gadB基因下游侧翼序列在NCBI中用Blastn搜索，E值设为10，未发现任何同源序列。改用Blastx

图6 gadB基因及其侧翼区的核苷酸序列Fig.6 Nucleotide sequcence of glutamate decarboxylase gene and flanking regions

3 讨 论

嗜热链球菌Y-2的谷氨酸脱羧酶基因gadB与谷氨酸/ γ-氨基丁酸逆向转运蛋白基因gadC在染色体上紧密相邻，两者距离只有二十几个核苷酸，在gadB上游十几核苷酸处发现有高度疑似启动子的序列，而gadC前则没有。这两个基因很可能是属于同一个操纵子，由同一个启动子驱动表达。细菌处于酸性环境下必须保证细胞内的pH值不能降得太低，谷氨酸脱羧酶、谷氨酸/ γ-氨基丁酸逆向转运蛋白一般与细菌的耐酸机制有关。细菌从细胞外把谷氨酸运到细胞内，由谷氨酸脱羧酶将其脱羧生成GABA，再由逆向转运蛋白将GABA运到细胞外。在一次脱羧反应中，酸性的氨基酸(谷氨酸)转变成了中性的氨基酸(GABA)，消耗了一个H+，这样就有利于维持细胞内pH值的稳定。虽然嗜热链球菌是来源于酸奶的益生菌，但它的gadBC排列方式与病原菌大肠杆菌、弗氏志贺菌的相同[12-13]，而与乳酸乳球菌、短小乳杆菌的排列方式gadCB相反[14-15]。值得注意的是，在用Blastp搜索嗜热链球菌谷氨酸脱羧酶的同源蛋白质时，发现双歧杆菌Bifidobacterium angulatum DSM20098、Bifidobacterium dentium ATCC27678分别有一个未知蛋白(ZP_04447568、ZP_02918104)，从序列同源性推断它们应该为谷氨酸脱羧酶GadB，从系统发育树(图2)来看，这两个推断的谷氨酸脱羧酶与嗜热链球菌的谷氨酸脱羧酶关系颇为接近。而且，类似于嗜热链球菌，这两个双歧杆菌谷氨酸脱羧酶的编码基因gadB下游也紧跟着编码氨基酸转运蛋白(ZP_04447567、ZP_02918103)的基因，从这两个蛋白质的序列同源性分析推断，它们应该是谷氨酸/γ-氨基丁酸逆向转运蛋白GadC。由此可见，在乳酸菌中，既有与嗜热链球菌的gadBC排列方式相同的双歧杆菌，也有排列方式相反的乳酸乳球菌、短小乳杆菌，gadB、gadC两个基因的排列顺序并无一定规律，但无论顺序如何，这两个基因在基因组中一般都紧密相连，以达到协调表达、维持细胞内pH值稳定的目的。

菌株Y-2谷氨酸脱羧酶基因gadB前的序列很可能是一个转座酶基因，这个基因在其他细菌(不局限于乳酸菌)的基因组中也可找到，是插入序列IS1216的转座酶。嗜热链球菌已有3个菌株(LMG18311, CNRZ1066，LMD-9)完成了全基因组序列分析[5-6]，它们均含有IS1216转座因子，但并未发现谷氨酸脱羧酶基因g a d B与谷氨酸/ GABA逆向转运蛋白基因gadC，可能gadBC在菌株Y-2中的出现与转座有关。虽然嗜热链球菌与肺炎链球菌同属，但它们的谷氨酸脱羧酶并没有同源关系。菌株Y-2的谷氨酸脱羧酶与具核梭杆菌、双歧杆菌的高度相似，而它们均是定居于人体口腔、肠道内的正常菌群，因此菌株Y-2的谷氨酸脱羧酶的起源是一个值得研究的问题。

目前国内外对乳酸菌的谷氨酸脱羧酶的研究是一个热点，已有多种乳酸菌的谷氨酸脱羧酶基因被克隆并表达，但对嗜热链球菌谷氨酸脱羧酶的分子生物学研究还是空白。研究嗜热链球菌谷氨酸脱羧酶的基因将对了解嗜热链球菌γ-氨基丁酸的生物合成及工业化生产有重要的作用。

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Sequence Analysis of Glutamate Gecarboxylase Gene and Flanking Regions from Streptococcus thermophilus Y-2

LIN Qian1，YANG Sheng-yuan2，LU Zhao-xin3,*，LFeng-xia3，BIE Xiao-mei3，ZOU Xiao-kui3
(1. Department of Chemistry and Biology, Yulin Normal University, Yulin 537000, China；2. Department of Biology, Hanshan Normal University, Chaozhou 521041, China；3. College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

The glutamate decarboxylase gene (gadB) and its flanking regions from Streptococcus thermophilus Y-2 were investigated by homologous search in GenBank with Blastn and Blastx. There was no any other gene showing significant similarity with gadB, while the protein product of gadB had high similarity with several bacterial glutamate decarboxylases. Phylogenetic tree based on glutmamte decarboxylase sequences indicated that Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum ATCC 10593 showed the closest relationship with S. thermophilus Y-2. The upstream flanking region of gadB was homologous to bacterial transposases, while the downstream flanking region of gadB encoding a putative protein was similar to bacterial glutamate/γ-aminobutyric acid antiporters (GadC). The order of gadB and gadC in S. thermophilus Y-2 genome was similar to that of E. coli and Shigella flexneri, but different from that of Lactococcus lactis and Lactobacillus brevis. Insertion sequence IS1216 was present in genomes of S. thermophilus LMG 18311, CNRZ1066, and LMD-9, but not gadB or gadC.

Streptococcus thermophilus；glutamate decarboxylase；γ-aminobutyric acid；sequence analysis

Q78

A

1002-6630(2011)03-0121-05

2010-06-02

广东省自然科学基金项目(8452104101001546)；国家星火计划项目(2008GA780032)；

玉林师范学院高层次人才科研启动基金项目(G2009042)

林谦(1977—)，男，博士，研究方向为工业微生物技术。E-mail：linqian1977@163.com

*通信作者：陆兆新(1965—)，男，教授，博士，研究方向为食品微生物及生物技术。E-mail：fmb@njau.edu.cn