氯化血红素对CdS量子点荧光的猝灭研究及分析应用

张文龙，张俊生，周丽萍，陈莉华

(吉首大学化学化工学院，湖南 吉首 416000)

氯化血红素对CdS量子点荧光的猝灭研究及分析应用

张文龙，张俊生，周丽萍，陈莉华*

(吉首大学化学化工学院，湖南 吉首 416000)

以巯基乙酸为稳定剂及表面修饰剂，在水溶液中合成了平均粒径为2.9nm左右的CdS 量子点，该量子点在512.4nm波长处有强的源于表面阱的空穴电子重组形成的表面态发射峰，加入的氯化血红素通过扩散和碰撞作用可将电子转移至CdS 量子点的空穴中导致量子点荧光发生动态猝灭，并在此基础上建立了测定氯化血红素的新型荧光分析法。在最佳测定条件下，当氯化血红素的质量浓度为5.0×10-6～25.0×10-6g/mL时，体系的相对荧光强度(F)与氯化血红素的质量浓度(ρ)呈线性关系，线性回归方程为：F=719.09－14.01×10-6ρ，检出限为3.35×10-8g/mL。测定血清样品基底中氯化血红素的含量并获得满意结果。

CdS量子点；氯化血红素；电子转移；荧光猝灭

量子点由于其量子尺寸效应所带来的特殊光学效应使其在DNA及蛋白质标记、活体细胞染色、生物芯片等领域获得广泛应用[1]。CdS是其中研究得最深入、应用也最为广泛的量子点，在探讨其作为荧光探针标记蛋白质[2]测定牛血清白蛋白[3]及与多肽[4]、半胱氨酸[5]的相互作用时，大多涉及到量子点与生物分子间的能量转移、表面吸附或修饰等作用机理，而对于量子点与生物分子之间的电子转移的研究报道较少。

从动物血中提取出来的氯化血红素( hemin)作为一种优良的天然色素、铁强化剂及抗贫血药，广泛应用于食品、医药和精细化工方面。它既是过氧化物模拟酶也是氧化还原蛋白，对氯化血红素的分析研究包括其作为过氧化物模拟酶与电极[6]或其他生物分子之间的电子转移[7-8]以及应用分光光度法、荧光分析[9]和化学发光法等方法对其分析测定，但对于氯化血红素与量子点特别是CdS量子点在溶液中的荧光行为研究甚少。

本实验合成了水溶性CdS量子点，使之与氯化血红素作用，发现氯化血红素将猝灭CdS量子点产生的源于表面阱的空穴电子重组形成的表面态发射，深入探讨了氯化血红素与量子点之间的猝灭机理，证明了其猝灭机理为电子转移引起的动态猝灭，并建立了相应的荧光分析方法。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

患者的血清从湘西自治州康复医院取样。

Cd(NO3)2苏州市振兴化工厂；硫代乙酰胺、巯基乙酸 湖南师范大学试剂厂；氯化血红素(溶解于0.01mol/L NaOH溶液，工作液质量浓度为100mg/L) 中国科学院上海生物化学研究所；B-R缓冲溶液；高纯N2气；实验中所用超纯水在25℃的电阻率为10～16MΩ·cm，电导率小于0.1μs/cm；其他试剂均为分析纯。

RF-5000荧光分光光度计 日本岛津公司；JEM3010高倍透射电镜 日本JEOL电子公司。

1.2 方法

1.2.1 CdS量子点的制备

[10-11]的方法，采用硫代乙酰胺作为反应剂，CdCl2提供镉源，经改进后用下述方法制备CdS量子点。配制40mL 含1.5×10-2mol/L CdCl2及4mL 巯基乙酸的混和溶液，用NaOH调节至透明无浑浊，此时pH值约为11左右。通N2除氧约10min，倒入三颈烧瓶内，放在恒温磁力搅拌器中，隔绝空气条件下缓慢升高温度，向其中滴加 40mL 1.0×10-2mol/L的硫代乙酰胺溶液([Cd2+]:[S2－]为1.5:1)。将溶液加热到96℃，在N2保护下搅拌 2.5h，回流3h，过滤，得淡黄色表面富含Cd2+的 CdS量子点溶胶。将该溶胶状液体与100mL 甲醇超声搅拌均匀，静置5h，离心分离大粒径 CdS，溶液经超声振荡，得到颗粒较为均匀的 CdS量子点。

1.2.2 巯基乙酸表面修饰CdS量子点

在PBS缓冲液中，将CdS量子点与一定量的巯基乙酸(1:1)，在室温下于超声波中振荡反应6h，取上层可溶功能性量子点备用。

1.2.3 CdS量子点测定氯化血红素

在15mL 比色管中，准确加入pH值为11. 20的B-R缓冲液2.0mL，0.6mL CdS纳米粒子溶液，加入不同质量浓度的氯化血红素溶液(标准曲线)或一定量的样品溶液(样品分析)，定容后放置 10min。在 380nm 激发波长下记录512.4nm波长处荧光强度 F，CdS量子点溶液的荧光强度为F0，加入氯化血红素后溶液的荧光强度为F。

2 结果与分析

2.1 电镜分析

图1 巯基乙酸透射电镜(TEM)图Fig.1 TEM image of CdS-TGA

由图1可见，所得巯基乙酸修饰的 CdS量子点粒径均匀，分散性好，可计算粒径在5 nm以下。

2.2 荧光光谱分析

图2 氯化血红素质量浓度对CdS荧光光谱的影响Fig.2 Effect of hemin concentration on fluorescence spectra of CdS

由图2可知，通常CdS有两种典型的特征发射峰，一个在520～570nm，另一个在410～490nm。410～490nm的峰是源于晶体本体的激发态重组的发射峰，520～570nm的峰是源于表面阱的空穴电子重组形成的表面态发射峰，其中表面态发光与纳米粒子的生长环境有关，受周围介质的影响强烈。以波长为380nm的光激发时，CdS 量子点在512.4nm波长处出现强的荧光峰，半高峰宽(full width at half maximum，FWHM)为49. 8nm，此发射带应为表面阱的空穴电子重组形成的表面态发射峰。

纳米粒子的尺寸D与其荧光峰λe之间有如下关系[12]：D=2.6786×1－4.9348×+3.4222×－1.0511 λe+127.74。

以此计算512.4nm波长处的荧光发射，可知合成的CdS 量子点粒径为2.9nm，该粒径计算结果与高倍透射电镜(TEM)表征互为佐证。加入氯化血红素后，体系的荧光峰强度逐渐减弱，最大荧光峰波长不变，说明氯化血红素的加入使CdS 量子点的荧光发生猝灭。

2.3 CdS-氯化血红素体系的吸收光谱

测定了CdS 量子点溶液、氯化血红素溶液及含等物质的量的CdS、氯化血红素混合溶液的紫外-可见吸收光谱，结果如图3所示。

图3 CdS-氯化血红素体系中各物质的吸收光谱图Fig.3 Absorption spectra of CdS-hemin (1), hemin (2) and CdS (3)

由图3可知，CdS-氯化血红素体系的紫外光谱相当于CdS和氯化血红素紫外光谱的叠加，没有新的谱峰出现，说明CdS和氯化血红素没有结合生成新的物质。

2.4 温度对氯化血红素猝灭CdS量子点荧光的影响

图4 温度对氯化血红素猝灭CdS荧光强度的影响Fig.4 Effect of temperature on CdS fluorescence quenching by hemin

用ΔF=F0－F为衡量指标，实验了不同温度下氯化血红素猝灭CdS量子点荧光的对应效果，由图4可知，在35℃时，体系的荧光强度下降最大，其后随着温度的上升，体系的ΔF变化不大，5 0℃时，体系的荧光强度下降又减小。因此本实验选择测定温度为35℃。

2.5 pH 值对氯化血红素猝灭CdS量子点荧光的影响

图5 pH值对氯化血红素猝灭CdS荧光强度的影响Fig.5 Effect of pH on CdS fluorescence quenching by hemin

pH值对量子点CdS及CdS-hemin体系的荧光峰位没有影响，但对相应的荧光强度有较大影响。本体系以B-R缓冲液调节溶液的pH值，考察不同pH 值对体系荧光猝灭程度ΔF的影响。由图5可知，在pH8.66时，体系的ΔF最大，但荧光强度F0较小。在pH 11.20时，荧光强度F0最大，这时ΔF也较大。综合考虑F0和ΔF的因素，本实验选择pH11.20的B-R缓冲溶液调节体系的p H值。

2.6 干扰离子对氯化血红素猝灭CdS量子点荧光的影响

在最佳实验条件下，按照氨基酸、糖类等主要生命元素实验共存物质对1.0×10-5g/mL氯化血红素猝灭CdS量子点荧光的影响，结果见表1。

表1 干扰离子对氯化血红素猝灭CdS量子点荧光的影响Table1 Effects of coexisting ions for CdS fluorescence quenching by hemin

由表1可知，大部分干扰离子没有干扰。

2.7 基于猝灭CdS量子点荧光的氯化血红素定量关系

微量氯化血红素可猝灭CdS量子点荧光，且随氯化血红素质量浓度增大猝灭程度加剧，基于此，可建立氯化血红素的分析方法，在选定的最佳条件下绘制标准曲线，在5.0×10-6～25.0×10-6g/mL 范围内，氯化血红素质量浓度(c)与体系相对荧光强度(F)有良好的线性关系，其线性回归方程为：F=719.09－14.01×10-6ρ(R2= 0.9995)。根据 IUPAC规定，检出限按3δ/K(δ为空白多次测得信号的标准偏差，K为方法的灵敏度，即校准曲线的斜率)计算为3.35×10-8g/mL。

2.8 样品分析

表2 氯化血红素样品含量测定结果Table2 Analytical results of hemin in human blood serum

以不同患者的血清作为基底加入氯化血红素按实验方法测定含量，表2的结果表明，血清中其他物质对氯化血红素测定没有干扰，可用于实际样品分析。

2.9 猝灭机理探讨

荧光猝灭过程通常分为动态猝灭和静态猝灭，常通过以下办法来区分是动态猝灭还是静态猝灭：1) 因动态猝灭依赖于分子间的扩散，升高温度会加速扩散，因而动态猝灭常数应随温度升高而增大；但升高温度将导致配合物的稳定性降低，因而静态猝灭常数应随温度升高而减小；2)由于动态猝灭只影响荧光分子的激发态，因而并不改变荧光物质的吸收光谱；而静态猝灭中，基态配合物的生成往往会导致荧光物质荧光吸收光谱的改变，即最大吸收波长发生红移或蓝移，或有新的谱峰出现；3)猝灭过程常数的不同。

下面从上述三方面进行猝灭方式的认定。

1)温度对猝灭的影响

其他条件不变，分别测定15、25、35、45℃温度各自的猝灭常数，结果如图6和表3所示，由此看出猝灭常数KSV随温度升高而增大，初步判断反应为动态猝灭。

图6 氯化血红素质量浓度对CdS量子点荧光猝灭的Stern-Volmer图Fig.6 Stern-Volmer curvers of CdS fluorescence quenching by hemin

表3 线性方程和相关系数Table3 Regression equations and correlation coefficients

2)紫外光谱与荧光光谱分析

作为荧光体的CdS 量子点在512.4nm波长处出现强的荧光峰，在200～450nm之间没有荧光发射，作为猝灭剂的氯化血红素的紫外吸收光谱最大峰出现在350nm和390nm波长处，390nm的吸收峰应是血红素的Soret 谱带特征峰。由氯化血红素的紫外光谱与CdS量子点荧光光谱的拟合图(图7)看出，CdS量子点的荧光发射光谱与氯化血红素的紫外吸收光谱交叠很少，即荧光体CdS和猝灭剂氯化血红素之间没有发生能量转移。

图7 氯化血红素的紫外光谱与CdS量子点荧光光谱的拟合图Fig.7 Overlap of hemin absorption spectrum (1) with CdS fluorscence spectrum (2)

3)假如该过程为动态猝灭过程，则有：Ksv=Kqτ0。式中：Kq为双分子猝灭过程速率常数；τ0为猝灭剂不存在时荧光体的平均寿命，一般半导体量子点的平均寿命为20～50ns。

假设本实验合成的巯基乙酸功能化的CdS量子点荧光寿命τ0= 30ns的话，用25℃的KSV值为2.48×104计算，可知其Kq为8.3×1010L/(mol·s)，该值与各类猝灭剂对生物分子的最大碰撞猝灭过程速率常数2.0×1010L/(mol·s)的值均在同一个数量级，进一步说明氯化血红素对CdS的猝灭属于动态猝灭。

图8 荧光猝灭机理推测图Fig.8 Speculative fluorescence quenching mechanism between hemin and CdS

大量研究表明，纳米粒子的猝灭机制可以通过能量转移[13]、电荷转移[14]及表面吸附分子[15]对表面态能级的改变等各种形式而改变整个体系的发光。对CdS纳米粒子来说，400～600nm范围的荧光发射光谱与氯化血红素分子400～600nm范围的吸收光谱交叠很少，因而可以忽略能量转移机制；氯化血红素与CdS进行碰撞后，CdS的荧光峰强度下降但最大吸收光谱没有蓝移或红移，说明没有发生表面吸附分子或氯化血红素取代巯基乙酸使CdS纳米粒子的化学环境和表面态能级发生改变，由此推测氯化血红素通过扩散和碰撞与CdS量子点发生氧化还原反应而进行电荷转移，氯化血红素提供的电子跃迁到量子点的空穴中导致CdS量子点的荧光发生动态猝灭，其动态猝灭常数随温度升高而增大，猝灭效果随猝灭剂质量浓度增大而加强，如图8所示。

参考文献：

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Fluorescence Quenching Mechanism of CdS Quantum Dots by Hemin and Its Application

ZHANG Wen-long，ZHANGF Jun-sheng，ZHOU Li-ping，CHEN Li-hua*
(College of Chemistry and Chemical Engineering, Jishou University, Jishou 416000, China)

CdS quantum dots were synthesized in aqueous solution by using mercaptoethylic acid as the stabilizer and surface-modification reagent. The 512.4 nm fluorescence emission which was caused by the cavity-electron recombination on surface trap of CdS quantum dots was quenched in the presence of hemin. The quenching mechanism was a dynamic process based on electron transfer between Fe2+of hemin and cavity of CdS quantum dots. Under optimal conditions, a concentration of 5.0×10-6－25.0×10-6g/mL of hemin could be determined on the basis of the decrease ratio of fluorescence intensity of CdS quantum dots,with a detection limit of 3.35×10-8g/mL. The proposed method was utilized to analyze the blood serum sample in which hemin was added with satisfactory results.

CdS quantum dots；hemin；electron transfer；fluorescence quenching

TS264.4

A

1002-6630(2011)03-0051-05

2010-03-15

湖南省教育厅自科基金重点项目(05A009)；湖南大学化学生物传感与计量学国家重点实验室开放课题(2005019)；吉首大学回校博士基金资助项目(JD05001)

张文龙(1987—)，男，硕士研究生，研究方向为纳米粒子荧光特性及分析应用。E-mail：wlaoxi@163.com

*通信作者：陈莉华(1961—)，女，教授，博士，研究方向为天然产物。E-mail：chenlihua99@163.com