30份莲种质资源的RAPD遗传多样性分析

吴景栋，刘生财，杨盛春，魏英辉，赖钟雄，罗银华，饶学雄，张锐，吴高杰

（1.福建建宁县莲籽科学研究所，354500；2.福建农林大学园艺植物生物工程研究所）

30份莲种质资源的RAPD遗传多样性分析

吴景栋1，刘生财2，杨盛春1，魏英辉1，赖钟雄2，罗银华1，饶学雄1，张锐2，吴高杰2

（1.福建建宁县莲籽科学研究所，354500；2.福建农林大学园艺植物生物工程研究所）

采用RAPD分子标记技术对30份莲（Nelumbo nuciferaGaertn.）种质资源的遗传多样性进行鉴定。筛选出14对有效引物进行PCR扩增，共产生2 146条带，其中有1 516条为多态性条带，各对引物的平均多态性条带为108.29条，扩增条带的多态率达70.64%。对所得到的30份莲种质资源的RAPD图谱进行组合和综合分析，结果表明花莲与子莲的相似遗传系数较高，说明这两种莲之间亲缘关系比较近。

莲；遗传资源；RAPD；亲缘关系

莲（Nelumbo nuciferaGaertn.）是历史悠久的古老植物，在长期的进化过程中，根据不同用途分化为子莲、花莲和藕莲3个类型[1，2]。由于莲是常异花授粉植物，不同品种间的基因交流易通过昆虫的授粉来完成，这就造成莲品种间遗传资源的混合和品种内的遗传变异较大，种质高度杂合[3，4]，采用分子生物学对其进行遗传多样性鉴定是十分必要的。

近几年来，利用分子标记技术在分子水平上研究莲的遗传多样性以及开展对莲种质资源保护的研究成为热点。RAPD分子标记技术具有简单、高效、易操作等优点，同时，其在有效分析莲的3大类型时是很有效的，还可以有效地发掘并利用莲种质资源中的特异基因，加快对莲种质资源的开发利用，提升莲的价值[5]。本研究采用RAPD技术，对福建省建宁县莲籽科学研究所收集保存的30个莲品种（系）进行了初步分析，研究品种（系）之间的遗传关系，了解这些品种（系）间的亲缘关系，为莲的分类、遗传图谱的构建、DNA的指纹分析以及莲的定向育种及种质资源保存等打下基础[6]。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为30个莲资源的嫩叶（均由福建省建宁县莲籽科学研究所提供），品种名称见表1。

1.2 试验方法

①莲基因组DNA的提取 参照陈义挺等[7]，孔德政等[8]，李焕苓等[9]的方法提取，提取物于-20℃下保存备用。

表1 莲品种的编号和名称

②基因组DNA的检测 以1.0%琼脂糖凝胶电泳检测分析DNA的完整性。取8 μL DNA上样，凝胶电泳，把胶块放到EB染色液中染色10 min，再用清水漂洗，放在凝胶成像仪下观察、拍照并保存。

③PCR扩增体系及反应程序 采用25 μL反应体系，其中DNA模板1 μL（50 ng/μL），10×PCR buffer 2.5 μL，dNTP（10 mmol/L）1.0 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.5 μL，随机引物（10 mmol/L）l μL，Mg2+2.5 μL，无菌双蒸水16.5 μL。

反应程序为：94℃预变性 3 min；94℃变性l min，38℃退火1 min，72℃延伸1 min，39个循环；72℃延伸10 min，于4℃下保存。PCR扩增反应结束后，采用l×TAE电泳缓冲液，于1.0%琼脂糖凝胶上电泳，EB染色。用GelDoc-It凝胶成像系统观察、拍照，记录结果。

④RAPD反应引物的筛选 本试验用形态差异较大、亲缘关系较远的莲（舒月、冬荷）DNA为模板，对上海Sangon生物工程公司生产的200个RAPD引物中随机挑选的48个随机引物（10 bp的寡聚核苷酸）进行筛选。

⑤数据分析方法[10]a.条带的记录。根据同一引物在相同电泳迁移位置的有无统计谱带，有带的记为1，无带的记为0，统计所有的二元数据，构建0，1矩阵。b.数据分析和处理方法。利用SPSS V13.0软件对30份莲资源进行聚类分析，建立遗传关系聚类树状图。

2 结果与分析

2.1 莲基因组DNA的提取质量

30份莲种质资源基因组总DNA经琼脂糖电泳结果如图1所示，基因组DNA电泳得到的条带，比较整齐、清晰，分子量较大且基本无降解、断裂，完整性好。另外，由图1可见，DNA电泳后呈现一条迁移率很小的整齐条带，但有少数弥散的荧光区出现，表明所提取的DNA样品有少量的糖和RNA污染；从电泳图谱中可知，所提DNA可以用于RAPD扩增。

图1 莲基因组总DNA琼脂糖电泳图谱

2.2 RAPD引物筛选

选择多态性好、条带清晰且稳定的14条引物作进一步分析。14条引物分别是：S107、S134、S158、S175、S70、S101、S102、S115、S142、S140、S160、S118、S138、S179（表2）。

表2 不同引物对30份莲种质资源的PCR扩增位点分析

2.3 30份莲的RAPD多态性分析

本研究选用14条引物对30份莲DNA基因组进行RAPD-PCR扩增，获得了不同基因组DNA扩增图谱。从表2和扩增结果电泳图（图2）可以看出，14个随机引物对30份莲的扩增共产生2 146条清晰且重复性较好的条带，不同引物获得的扩增带为59～226条，每个引物平均扩增条带数为153.29条；其中有1 516条为多态性条带，平均多态性条带为108.29条，扩增条带的多态率达70.64%。

图2 部分引物的扩增结果

2.4 30份莲RAPD的聚类分析

根据RAPD扩增结果，统计得到的谱带，建立遗传相似矩阵，利用SPSS V13.0软件的Withingrouplinkage和Jaccard对30份莲资源进行分析，获得Jaccard相似系数表，结果如表3所示。花莲与子莲的相似遗传系数比较高，这说明2种莲之间的亲缘关系比较近。

根据欧氏距离（ED）法计算各样品间的遗传距离，利用SPSS V13.0软件的Within-grouplinkage和Jaccard对30份莲资源进行分析，建立遗传关系聚类树状图（图3），进一步揭示了30份莲资源间的亲缘关系。从聚类图上明显可以看出，当遗传距离D= 15.00时，30份莲种质分为3大组：第1组为3，4；第2组为5，16，17；其余25个品种为1组。当遗传距离D=13.00时，可把30份建莲种质分为5组：第1组为3，4；第2组，5（冬瓜莲）单独为1组；第3组为16，17；第4组为25，26，27，28，29，30；其余19个品种为第5组。当遗传距离D=7.50时，30份莲种质可分为14组。

表3 30份莲种质资源分子标记的遗传相似系数

3 结论与讨论

RAPD分子标记技术具有简单、高效、易操作等优点，但RAPD技术是由多种微量成分参加的生化反应，反应十分灵敏，反应体系及条件稍有变化，便会对其结果产生影响，因其影响因素较多，所以结果会出现重复性差等问题[9，11，12]。

图3 30份建莲资源的聚类分析

而RAPD技术在分析花莲、子莲、藕莲时是很有效的[5]，因此本研究采用该技术对30份莲种质资源进行鉴定分析是可行的。在研究中发现，子莲和花莲可以归类为一个聚群，其原因可能是由于子莲与花莲之间的遗传距离较近的原因。莲是常异花授粉植物，不同品种间的基因交流很容易通过昆虫的授粉来完成，这就造成品种间遗传资源的混合和品种内的遗传变异较大。本研究也发现，即使是同一地区的不同品种间也会有很大差别[13]。

RAPD技术的应用使在DNA分子水平上研究莲资源遗传多样性成为可能，对分析莲不同品种的系谱关系、亲缘品种群间的系统发生关系及分类地位等方面都起着重要的作用。

[1]王其超，张行言，胡春根．荷花品种分类新系统[J]．武汉植物学研究，1997，15（1）：19-26．

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[3]薛建华，卓丽环，周世良．黑龙江野生莲遗传多样性及其地理式样[J]．科学通报，2006，51（3）：299-308．

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[5]郭宏波，李双梅，柯卫东．花莲种质资源的遗传多样性及品种间亲缘关系的探讨[J]．武汉植物学研究，2005，23（5）：417-421．

[6]郑宝东，郑金贵，曾绍校．中国莲子种质资源遗传多样性的RAPD分析[J]．中国食品学报，2006，6（1）：138-143．

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[8]孔德政，刘艺平，田云芳．改良CTAB法对碗莲叶片基因组DNA提纯效果的影响[J]．沈阳农业大学学报，2005，36（4）：428-431．

[9]李焕苓，赖钟雄，陈义挺，等．66份荔枝古树遗传多样性的RAPD分析[J]．热带作物学报，2009，30（4）：450-455．

[10]董艳．福建尤溪金柑RAPD分析及柑桔类种质资源的离体保存研究[D]．福州：福建农林大学，2010．

[11]蔡英卿，赖钟雄，陈义挺，等．福建余甘子遗传资源的RAPD分析[J]．热带作物学报，2007，28（2）：74-79．

[12]王玲，郑金贵，赖钟雄，等．辣椒遗传多样性的RAPD分析[J]．福建农林大学学报：自然科学版，2003，32（2）：213-216．

[13]郭宏波，柯卫东，李双梅，等．野生莲资源的RAPD分析[J]．植物学通报，2005，22（增刊）：64-67．

Analysis on Genetic Diversity of 30 Lotus(Nelumbo nuciferaGaertn.) Germplasm Resources by RAPD Maker

WU Jingdong1,LIU Shengcai2,YANG Shengchun1,LAI Zhongxiong2,WEI Yinghui1,LUO Yinhua1, RAO Xuexiong1,ZHANG Rui2,WU Gaojie2
(1.Research Institute of Seed Lotus,Jianning County,Fujian 354500; 2.Institute of Horticultural Biotechnology,Fujian Agriculture and Forestry University)

Genetic diversity of 30 lotus germeplasms was analyzed by RAPD marker.14 pair primers were adopted to analyze polymorphism in RAPD amplification,with 2 146 RAPD bands obtained.1 516 were polymorphic bands,with average polymorphic bands of 108.29 per pair of primers,covering 70.64%of the total bands.The RAPD map of 30 lotus germplasm resources was combined and comprehensively analyzed.The results showed that the genetic similarity coefficient between flower lotus and seed lotus was relatively high,indicating their close genetic relationship.

Lotus;Germplasm resources;RAPD;Genetic relations

10.3865/j.issn.1001-3547.2011.16.017

国家公益性行业（农业）科研专项经费资助

吴景栋（1972-），男，高级农艺师，研究方向为子莲育种和栽培，电话：0598-3960965，E-mail：wjd3960965@126.com

赖钟雄（1966-），男，通信作者，博士，博士生导师，研究员，研究方向为园艺植物生物技术与遗传资源，电话：0591-83789484，E-mail：Laizx01@163.com

2011-07-15